单分子水合状态蛋白质三维化学映射的原子探针层析成像技术研究

第一作者及机构
本研究的通讯作者为澳大利亚迪肯大学（Deakin University）的Ross K. W. Marceau和莫纳什大学（Monash University）的Jing Fu，其他主要作者包括Shi Qiu、Changxi Zheng等。研究发表于《Analytical Chemistry》期刊2020年3月刊（Volume 92, Issue 8, Pages 5168–5177）。

学术背景
本研究属于结构生物学与纳米表征技术交叉领域，旨在解决传统技术（如X射线晶体学、核磁共振NMR、冷冻电镜cryo-EM）在单分子水平化学组成分析中的局限性。尽管冷冻电镜能解析蛋白质结构，但其依赖大量分子平均化数据，且难以实现近原子级化学组成映射。原子探针层析技术（Atom Probe Tomography, APT）作为一种新兴的三维纳米级成分分析工具，此前仅适用于脱水生物样本。本研究通过创新性引入石墨烯封装技术，首次实现了水合状态下单蛋白质（铁蛋白ferritin）的近原子级三维化学成像，目标包括：
1. 开发适用于水合生物样本的APT样品制备方法；
2. 解析铁蛋白核心（铁/铁氧化物）与肽壳（氨基酸）的界面结构；
3. 定量测定铁同位素比例及氨基酸分布。

研究方法与流程
1. 样品制备
- 钨针尖预处理：通过聚焦离子束（FIB）环形铣削将钨针尖尖端半径控制在20–40 nm，以满足APT场电离要求。
- 石墨烯封装：采用化学气相沉积（CVD）制备的单层石墨烯膜，通过液膜转移法将铁蛋白溶液（0.5 mg/mL）封装于针尖表面，重复1–3次以增加溶液体积。石墨烯的导电性和机械强度保障了水合状态的维持（图1a）。
- 冷冻固定：样本在液氮温度（<113 K）下冷冻，避免水合状态破坏。

1. 电子显微镜验证

   • STEM与EDS：扫描透射电镜（STEM）确认铁蛋白颗粒均匀分布，核心直径5.27±0.72 nm（图2c-d）；能谱分析（EDS）显示铁（Fe）、碳（C）、氮（N）、氧（O）的分布符合铁蛋白组成（图2e）。
     
   • 冷冻FIB-SEM：验证冷冻后样本完整性，未发现石墨烯封装导致的损伤（图2f）。
     

2. 原子探针层析成像（APT）

   • 实验参数：激光脉冲模式（200 kHz，20 pJ），超高真空（<10⁻¹¹ Torr），35 K低温。
     
   • 数据采集：通过飞行时间质谱鉴定离子种类（如Fe²⁺、H₂O⁺、氨基酸碎片离子），并基于探测器位置重建三维化学图谱（图3c）。
     
   • 聚类分析：采用最大分离算法（阈值0.5 nm）和基于密度的聚类算法，区分铁核心（Fe²⁺、P⁺）与肽壳（C/N/O/H离子），并定位氨基酸位点（图4d）。
     

主要结果
1. 铁蛋白核心-壳结构解析
- 核心：由Fe²⁺、P⁺及铁氧化物（如FeO₂²⁺）组成，直径2.8–3.5 nm，磁铁矿（Fe₃O₄）富集于核心-壳界面（图4a-c）。
- 肽壳：含C/N/O/H的离子分布半径3.5–7 nm，通过COOH₃⁺与CNH₂⁺聚类定位氨基酸位点（图4d）。
- 水合层：H⁺与O⁺的空间关联证实了水分子存在（图3c）。

1. 铁同位素定量

   • 聚类分析排除质谱峰重叠干扰后，测得⁵⁶Fe/⁵⁴Fe比例为8.4（n=8），低于自然丰度比（15），可能与生物矿化过程中的动力学同位素效应相关（图6b）。
     

2. 方法验证

   • 石墨烯封装未改变铁蛋白结构（STEM验证），APT数据重现性良好（8次独立实验）。
     

结论与意义
1. 科学价值
- 首次实现水合状态单蛋白质的三维化学成像，填补了冷冻电镜在化学成分分析中的空白。
- 为生物大分子（如病毒颗粒、药物-靶标复合物）的原位研究提供了新范式。

1. 技术创新

   • 石墨烯封装技术：解决了APT生物样本制备中的导电性与水合状态维持难题。
     
   • 冷冻-APT联用：为冷冻电子断层扫描（cryo-ET）等技术的互补应用奠定基础。
     

2. 应用前景

   • 可扩展至细胞器、病原体等亚细胞结构的化学成分与相互作用研究，推动精准药物设计。
     

研究亮点
1. 单分子分辨率：首次在近原子尺度（横向0.3 nm，深度0.1 nm）解析铁蛋白核心-壳界面化学组成。
2. 同位素分析：实现单分子内铁同位素的定量测定，为生物矿化机制研究提供新工具。
3. 方法普适性：无需FIB切割的样品制备流程，可适配多种生物大分子研究。

其他价值
- 研究数据通过聚类算法公开（MATLAB代码），支持后续APT生物数据分析的标准化（参考文献17-18）。
- 提出的“水合APT”框架可与X射线荧光显微术（XFM）、原子力显微术（AFM）等多模态技术联用（参考文献44-49）。