本研究由成都中医药大学药学院、西南特色中药资源国家重点实验室的Peng Guo、Pengkun Lei、Lin Luo等人，以及青海青藏高原民族药炮制与制剂研究与应用重点实验室的Rui Zeng共同完成。通讯作者为Yan Qu和Chen Zhang。该研究于2024年发表在《Journal of Nanobiotechnology》期刊上（2024, 22:724），论文标题为“Microfluidic-engineered Chinese herbal nanocomposite hydrogel microspheres for diabetic wound tissue regeneration”。

学术背景

糖尿病是一种以高血糖、胰岛素抵抗和胰岛素过度分泌为特征的代谢性疾病，已成为全球范围内的重要公共卫生问题。糖尿病溃疡是糖尿病的严重并发症之一，约有25%的糖尿病患者会发生糖尿病足溃疡，其中20%的患者会发展至需要截肢的中重度溃疡。皮肤创面修复是一个涉及创面应激、炎症反应、肉芽组织形成以及表皮和其他组织再生的复杂病理生理过程。然而，糖尿病创面由于局部缺血、缺氧、高血糖和慢性炎症反应，导致炎性细胞浸润、新生血管形成障碍、胶原沉积减少以及肉芽组织发育不良，最终使创面愈合显著延迟。免疫应答受损和血管生成不足是糖尿病创面修复迟滞的主要机制。

针对这些问题，工程化聚合物水凝胶因其与细胞外基质结构高度相似而受到广泛关注。但传统水凝胶的纳米级孔隙结构虽允许小分子扩散，却阻碍了细胞和血管的浸润，限制了组织再生。水凝胶微球（hydrogel microspheres, HMs）作为一种微结构化水凝胶，具有高比表面积、可精确调控、可注射性等优势。微流控工程技术可在微通道内精确操控流体，具有高精度、可重复性和自动化等优点，是组织工程与再生医学领域的重要工具。在天然材料方面，中药白及（Bletilla striata）的主要活性成分白及多糖（Bletilla striata polysaccharide, BSP）是一种由α-甘露糖、β-葡萄糖和β-甘露糖组成的葡甘露聚糖，具有促进细胞增殖、迁移和胶原沉积的作用，并能通过甘露糖受体促进巨噬细胞向M2型转化，从而调节糖尿病创面的免疫微环境。20(S)-原人参二醇（20(S)-protopanaxadiol, PPD）是从五加科人参属植物中提取的达玛烷型皂苷苷元，能够促进血管内皮因子分泌，通过激活PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK信号通路促进血管生成，但其水溶性差限制了临床应用。

本研究旨在利用微流控技术和光交联技术，以BSP为基质材料，制备负载PPD脂质体（PPD-lipo）的纳米复合水凝胶微球（PPD-lipo@HMs），用于糖尿病创面组织修复。研究目标是通过脂质体递送PPD促进血管生成，利用BSP调节免疫微环境，从而协同加速糖尿病创面愈合。

详细研究流程

研究首先通过薄膜水化法制备PPD脂质体。将30 mg卵磷脂和6 mg PPD溶于无水乙醇，在50 °C下蒸发形成脂质薄膜，加入去离子水在37 °C水化30分钟，超声处理5分钟后得到PPD-lipo。采用动态光散射测定粒径分布和电位，透射电子显微镜观察形貌，并连续7天监测粒径和多分散指数以验证稳定性。包封率通过0.22 μm微孔滤膜过滤后超声破乳，以HPLC测定药物含量计算。

随后合成甲基丙烯酰化白及多糖（BSPMA）。将BSP溶于去离子水，加入甲基丙烯酸酐，用4% NaOH维持pH在8.0–8.5，反应24小时后透析3天，冻干得到BSPMA。通过1H-NMR确认甲基丙烯酸基团接枝成功，取代度为43%。FT-IR进一步验证了合成，1735 cm⁻¹处羰基伸缩振动峰增强表明反应完成。小瓶倒置实验证实BSPMA可光固化形成水凝胶。压缩力测试表明，随着BSPMA溶液浓度增加，最大压缩力增大，说明可通过前驱体溶液浓度间接调控微球力学性能。

水凝胶微球的制备采用微流控芯片。内相为含0.5% LAP光引发剂的BSPMA水溶液，外相为含5% Span 80的石蜡油。通过精密推泵将两相注入微流控芯片，外相剪切内相溶液形成液滴，经紫外光交联形成HMs。为探究流动参数对HMs形态的影响，内相流速在0.2–0.7 ml/h范围内变化，外相流速在2–7 ml/h范围内变化。结果显示，在外相流速固定时，增大内相流速可使HMs尺寸增大，但流速过高会导致纤维形成而非液滴；在内相流速固定时，增大外相流速使HMs粒径减小，但过高的外相流速同样抑制HMs形成。此外，内相BSPMA浓度从0.5%增至2%时，HMs尺寸增大而生成速率降低。所有HMs组均呈球形且粒径呈单峰分布。

PPD-lipo@HMs的制备中，内相为含0.5% LAP的1% BSPMA/PPD-lipo溶液（50 mg BSPMA溶于5 ml PPD-lipo溶液），内外相流速分别为0.4 ml/h和5 ml/h。光学显微镜显示微球形态均匀完整，平均粒径为332.35 ± 22.24 μm。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示FITC标记的PPD-lipo在罗丹明标记的HMs内均匀分布，3D荧光扫描进一步证实了脂质体在微球内部的均匀分散。扫描电子显微镜（SEM）显示微球表面具有多孔结构，有利于PPD释放。

体外性能表征方面，溶胀实验显示HMs和PPD-lipo@HMs在30分钟内分别达到1843%和1658%的溶胀率，能快速吸收液体并维持湿润环境。热重分析显示两种微球在200–400 °C区间发生主要质量损失，源于BSP分子链降解，添加PPD-lipo并未影响热稳定性。体外酶降解实验中，两种微球在1%溶菌酶PBS中均呈现缓慢降解模式，SEM观察显示第1周后表面塌陷，第3周后内部框架暴露。药物释放实验表明PPD在PPD-lipo@HMs中的包封率为76.99 ± 10.01%，略低于PPD-lipo的87.38 ± 10.51%，归因于除油过程中脂质体暴露导致的药物泄漏。释放曲线呈双相模式，PPD-lipo@HMs的释放较游离PPD和PPD-lipo更为持续。

血液相容性实验中，各浓度下PPD-lipo、HMs和PPD-lipo@HMs的溶血率均低于5%。小鼠肝脏出血模型显示，PPD-lipo@HMs组的失血量（59.37 ± 15.36 mg）显著低于HMs组（202.53 ± 50.37 mg）和空白组（97.37 ± 41.11 mg）。细胞实验中，L929成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）经不同样品共培养后，活/死染色显示各组细胞形态和活性良好，CCK-8检测24小时和48小时细胞存活率均超过90%，细胞骨架染色显示细胞形态正常且有丝状突起。

细胞迁移实验中，划痕实验显示PPD-lipo@HMs组对L929和HUVECs迁移的促进作用最为显著。血管形成实验中，培养4小时后，对照组血管形成较少，而PPD-lipo@HMs组血管节点数和毛细血管总长度均显著高于其他组。巨噬细胞极化实验中，经LPS诱导后，PPD-lipo@HMs处理的RAW264.7细胞中M2型巨噬细胞（CD206阳性）比例最高（7.62%），表明其能有效促进巨噬细胞向M2型转化。

体内实验中，通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立SD大鼠1型糖尿病模型，血糖水平超过16.67 mmol/L。在大鼠背部制作8 mm全层皮肤缺损，分别给予生理盐水、PPD-lipo、HMs和PPD-lipo@HMs处理。第7天时，HMs组和PPD-lipo@HMs组的创面愈合面积分别为64.84%和67.99%，显著高于对照组（34.27%）和PPD-lipo组（35.42%）。第14天，PPD-lipo@HMs组创面愈合率达到94.22%，显著高于HMs组（90.33%）、PPD-lipo组（87.84%）和对照组（84.76%）。H&E染色显示第14天PPD-lipo@HMs组肉芽组织间隙最小（3.00 ± 0.80 mm），表皮厚度最大。Masson三色染色显示第14天PPD-lipo@HMs组胶原沉积密度为56.30 ± 3.64%，显著高于对照组（37.73 ± 3.47%）、PPD-lipo组（39.23 ± 1.07%）和HMs组（47.70 ± 10.69%）。免疫荧光染色显示PPD-lipo@HMs组α-SMA和CD31表达显著升高，表明血管新生增强。CD86和CD206免疫荧光以及MPO免疫组化分析显示，PPD-lipo@HMs能有效降低创面炎症反应，促进M2型巨噬细胞极化。

主要结果

研究成功制备了粒径均一、稳定性良好的PPD脂质体，平均粒径为118.50 ± 2.24 nm，多分散指数为0.194，连续7天粒径和PDI保持稳定。BSPMA的取代度为43%，可通过紫外光交联形成水凝胶。微流控制备的HMs和PPD-lipo@HMs粒径分布均匀，PPD-lipo在HMs内部分散均匀。PPD-lipo@HMs具有优异的溶胀性能、热稳定性和可控降解性能，其体外药物释放呈持续缓释模式。血液相容性实验显示所有材料溶血率均低于5%，具有良好的血液安全性。细胞实验证实PPD-lipo@HMs可促进L929和HUVECs的增殖、迁移和血管形成，并能有效促进巨噬细胞向M2型极化。糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型中，PPD-lipo@HMs显著加速创面愈合、促进胶原沉积和血管新生、减轻炎症反应。

结论

本研究开发了一种以白及多糖为基质、负载PPD脂质体的新型天然纳米复合水凝胶微球。通过微流控工程和光交联技术精确调控流体速度和基质浓度，实现了对微球尺寸、比表面积和物理性质的精确控制。与传统水凝胶相比，PPD-lipo@HMs的微孔结构有利于细胞和血管的浸润与增殖。PPD的持续释放可显著促进血管生成，而BSP基质则通过调节巨噬细胞极化改善免疫微环境。体外和体内实验均证实PPD-lipo@HMs能有效促进细胞浸润、扩散和增殖，协调血管生成和免疫调节，最终加速糖尿病创面组织再生。该研究将微流控工程技术与中药材料相结合，提出了一种可持续、低成本、可扩展的天然纳米微复合材料的制备平台，为个性化复合生物材料的定制提供了新策略。

研究亮点

本研究的创新性体现在以下几个方面：首次将微流控和光交联技术用于构建白及多糖纳米复合微球；利用脂质体递送PPD解决了其水溶性差的问题，实现了持续药物释放；通过BSP的甘露糖受体靶向作用调节巨噬细胞极化，协同PPD的促血管生成作用，实现了对糖尿病创面微环境的多重调控；组织工程化纳米复合微球可有效填充不规则创面，促进细胞迁移和增殖，为糖尿病创面修复提供了新的治疗策略。