关于“使用骨基质仿生羟基磷灰石杂化生物墨水工程化构建大规模自矿化骨类器官”的研究报告
本研究由Jian Wang, Yan Wu, Guangfeng Li, Fengjin Zhou, Xiang Wu, Miaomiao Wang, Xinru Liu, Hua Tang, Long Bai, Zhen Geng, Peiran Song, Zhongmin Shi, Xiaoxiang Ren*, and Jiacan Su* 共同完成。研究团队主要来自上海大学转化医学研究院、肌肉骨骼类器官研究中心、国家转化医学科学中心上海大学分中心、上海大学医学院，以及上海交通大学医学院附属新华医院骨科、上海交通大学医学院附属第六人民医院骨科、西安市红会医院骨科、上海中冶医院创伤骨科等机构。该研究成果以题为《Engineering large-scale self-mineralizing bone organoids with bone matrix-inspired hydroxyapatite hybrid bioinks》发表于 Advanced Materials 期刊，在线发表日期为2024年（卷36，文章号2309875）。
一、 研究的学术背景
本研究属于骨组织工程与再生医学领域。大段骨缺损的修复是临床面临的重大挑战，由于骨组织自我修复能力有限，常导致愈合延迟和不愈合。当前临床解决方案（如金属植入物、同种异体移植物等）存在供体有限、疾病传播风险、骨整合不良等缺点。因此，开发更有效的骨再生策略至关重要。
类器官技术，特别是源自干细胞的类器官，在模拟天然器官功能方面展现出巨大潜力。然而，骨类器官的发展受到特定需求的阻碍：首先，骨骼作为身体的支撑结构，其类器官需要能够提供大规模机械支持的支架；其次，骨组织的细胞外基质是一种独特的无机/有机杂化结构，其中羟基磷灰石作为关键的无机组分，提供了骨组织的硬度和强度。因此，构建骨类器官不仅需要模拟其复杂的多细胞三维结构，更需要重现这种杂化的细胞外基质微环境。
生物打印技术为复制骨组织的复杂结构提供了强大手段。此前的研究中，团队已成功配制了由甲基丙烯酰化明胶/甲基丙烯酰化海藻酸盐/羟基磷灰石组成的杂化生物墨水，并证明了其良好的成骨特性。但该生物墨水在构建负载细胞的骨类器官方面的潜力，尤其是在促进大规模骨类器官长期培养、成熟和功能化方面的作用，尚待深入探索。本研究旨在利用这种受天然骨基质启发的、具有自矿化特性的生物墨水，通过数字光处理生物打印技术，构建大规模、具有功能化骨细胞外基质模拟结构的三维骨类器官，并系统评估其体外矿化、体内成熟、多细胞分化及骨缺损修复能力，以推动骨组织工程领域的发展。
二、 详细的研究流程
本研究是一个系统性的工程与生物学验证过程，主要包含以下几个核心环节：
1. 生物墨水与打印支架的制备与表征： 研究首先制备了三种生物墨水：纯GelMA、GelMA/AlgMA混合物、以及GelMA/AlgMA/HAP杂化生物墨水。利用数字光处理生物打印技术，将这些墨水打印成多孔圆柱体等多种复杂结构（如猫头鹰、兔子模型），用于后续实验。研究系统表征了打印支架的性能： * 形貌与结构： 通过扫描电子显微镜和冷冻SEM观察，证实打印支架具有精确的多孔结构，GelMA/AlgMA/HAP组显示出更均匀的微孔结构，有利于细胞矿化。能量色散X射线光谱分析显示GelMA/AlgMA/HAP支架表面存在钙、磷元素，而其他两组没有。 * 机械性能： 通过压缩测试评估力学性能。GelMA/AlgMA/HAP复合水凝胶的压缩强度和压缩模量（170 kPa / 0.40 MPa）显著高于GelMA组（50 kPa / 0.09 MPa）和GelMA/AlgMA组（57 kPa / 0.12 MPa），表明纳米HAP的引入极大增强了支架的机械强度，更接近骨组织的力学要求。 * 溶胀与降解： 体外溶胀和降解实验表明，GelMA/AlgMA/HAP组的溶胀速率较慢，平衡溶胀比较低，且在28天内降解更缓慢（约剩余12%质量），而纯GelMA在14天内几乎完全降解。这种可控的降解特性有利于与骨再生速率匹配。 * 离子释放： 通过电感耦合等离子体质谱监测钙离子释放，发现GelMA/AlgMA/HAP能持续稳定释放钙离子（约2周后稳定在300 ppm），这种持续的钙离子供应有利于促进成骨。
2. 三维生物打印支架的体外细胞相容性与长期培养： 将骨髓间充质干细胞封装在上述三种生物墨水中并打印成支架。通过活/死细胞染色和CCK-8实验评估细胞活力与增殖。结果显示，所有组别的细胞在14天培养期内均保持高活性。值得注意的是，细胞在GelMA/AlgMA/HAP支架中分布更均匀，并随时间迁移至支架表面，逐渐增殖并延伸形成复杂的三维细胞网络，表明该支架能为细胞长期生存和生长提供稳定的支持，为骨类器官的形成奠定了基础。
3. 三维生物打印支架的体外成骨分化与自矿化能力评估： * 成骨分化标志物检测： 将负载细胞的支架在成骨诱导培养基中培养。40天后，通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色评估成骨分化与矿化。结果显示，GelMA/AlgMA/HAP组的ALP表达和钙结节沉积最为显著。定量分析显示，其ALP和ARS活性分别是GelMA组的近6倍和9倍。 * 基因与蛋白表达分析： 通过RT-PCR和Western Blot检测成骨相关基因（Runx2, Col1a1, OCN, OPN）和蛋白（Runx2, BMP-2, OCN）的表达。GelMA/AlgMA/HAP组的所有成骨标志物表达水平均显著高于其他两组，证明其在基因和蛋白层面均能有效促进BMSCs的成骨分化。 * 体外自矿化监测： 使用微型计算机断层扫描在体外培养20天和40天后监测支架的矿化情况。μCT图像和定量分析（总矿化体积TMV、类器官矿物密度OMD、骨矿物质密度BMD、骨体积分数BV/TV等）清晰表明，GelMA/AlgMA/HAP组在40天内发生了显著的矿物沉积，且矿化从外围向内部扩展，矿化密度随时间增加。而GelMA和GelMA/AlgMA组仅观察到极少的矿化斑点。不含细胞的GelMA/AlgMA/HAP材料浸泡后并未自矿化，证明矿化过程依赖于细胞的活性。
4. 体内骨类器官的形成、自矿化与多细胞分化研究： 将体外预培养3天的生物打印支架植入裸鼠皮下，分别在20天和40天后取材分析。 * 组织学与免疫组化： H&E染色显示，GelMA/AlgMA/HAP组中细胞均匀分布在整个支架内，而其他两组细胞主要聚集在支架边缘。免疫组化染色（OCN, OPN, Runx2）表明，GelMA/AlgMA/HAP组在20天时就表现出强烈的骨形成信号，且强度随培养时间增加。 * 多细胞分化验证： 通过免疫荧光染色证实了多细胞谱系的存在。GelMA/AlgMA/HAP组中可检测到软骨细胞标志物（胶原II）、脂肪细胞标志物（Perilipin）和成骨细胞标志物（Periostin），表明BMSCs在体内微环境下分化为多种骨相关细胞。四重免疫荧光进一步证实了多细胞分化结构的存在。 * 三维结构可视化： 应用组织透明化技术结合3D免疫荧光成像，在40天的骨类器官内部观察到了明显的血管样管腔结构（CD31标记），且软骨标志物减少，提示可能经历了软骨内成骨过程，并形成了复杂的内部血管网络。 * 体内自矿化与机械性能： μCT分析显示，皮下植入的GelMA/AlgMA/HAP支架在体内形成了明显的骨样矿化结构，TMV和OMD值远高于其他组，且40天时的结构更为致密。纳米压痕测试表明，培养40天的骨类器官的杨氏模量达到0.414 GPa，硬度达到0.052 GPa，其机械性能已接近大鼠松质骨（杨氏模量0.652 GPa，硬度0.11 GPa），显著优于纯水凝胶材料。 * 超微结构与成分分析： SEM显示，40天后的GelMA/AlgMA/HAP形成了类似松质骨的多孔结构，并观察到了类似红细胞的细胞形态。EDS能谱分析证实了该组含有显著的钙、磷元素（Ca: 29.18 wt%, P: 13.70 wt%），接近天然松质骨成分。TEM观察到了羟基磷灰石的晶体相和细胞外基质中的胶原样物质。
5. 骨类器官形成机制的探索： 对体内培养4周后的支架进行mRNA测序分析。转录组学结果显示，与GelMA组相比，GelMA/AlgMA/HAP组有大量基因表达发生显著变化。GO功能富集分析显示，差异基因富集在“血管生成正调控”、“细胞粘附”、“细胞迁移正调控”、“胶原-containing ECM”等与骨生成密切相关的生物学过程和细胞组分。KEGG通路分析表明，PI3K-Akt信号通路是最显著富集的通路之一。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析也揭示了与成骨和破骨细胞分化相关的关键蛋白（如CXCR4, PDGFA, VEGFD, FGF2等）之间存在复杂的相互作用。这些结果表明，HAP可能通过激活PI3K-Akt等关键信号通路，调控一系列与血管生成、细胞外基质组装和细胞分化相关的基因，从而驱动骨类器官的形成和重建。
6. 骨类器官在骨缺损修复中的应用验证： 在大鼠颅骨制造5毫米临界尺寸缺损模型，植入预制的生物打印支架（含细胞）。术后4周和8周的μCT评估显示，GelMA/AlgMA/HAP组的新骨形成量（BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）和小梁数量（Tb.N）均显著优于其他组和空白对照组。组织学染色（H&E, Masson）和免疫组化（OPN, Runx2, VEGF）进一步证实，GelMA/AlgMA/HAP组具有更丰富的新生骨组织、更成熟的胶原排列以及更强的血管生成和成骨蛋白表达。对修复后骨组织的RNA-seq分析再次强调了“ECM-受体相互作用”、“PI3K-Akt信号通路”和“钙信号通路”在GelMA/AlgMA/HAP促进骨再生中的关键作用。
7. 生物安全性与体内降解评估： 通过小动物活体成像追踪Cy5.5标记的支架在体内的降解情况，发现GelMA/AlgMA/HAP支架在35天内完全降解，降解速度适中。血液生化指标分析和主要器官的H&E染色表明，植入材料未引起明显的全身毒性反应或器官损伤，证明了其良好的生物相容性和安全性。
三、 主要研究结果
本研究取得了一系列系统性且层层递进的结果： 1. 成功开发并表征了一种新型骨基质仿生生物墨水（GelMA/AlgMA/HAP），该墨水具有良好的打印精度、适宜的孔隙结构、显著增强的机械性能、可控的降解速率和持续的钙离子释放能力。 2. 证实了该生物墨水优异的生物相容性，能支持BMSCs长期存活、增殖并在三维空间内扩展形成网络，为复杂组织构建提供了细胞基础。 3. 在体外证明了GelMA/AlgMA/HAP支架强大的成骨诱导和自矿化能力。负载BMSCs的该支架能显著上调成骨基因和蛋白表达，并在无外加生长因子的情况下，于40天内实现从外到内的显著矿化，形成高矿物密度的结构。 4. 在体内成功构建了功能化的大型骨类器官。皮下植入实验表明，GelMA/AlgMA/HAP支架能在体内微环境中引导BMSCs向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多谱系分化，并形成具有血管网络的复杂结构。该结构发生了显著的自发矿化，其矿物含量、微观多孔结构（SEM）和晶体相（TEM）均与天然松质骨相似。 5. 实现了骨类器官机械性能的跨越式提升。体内成熟后的骨类器官杨氏模量达到GPa级别，与天然松质骨处于同一数量级，解决了水凝胶类材料机械强度不足的关键瓶颈。 6. 初步揭示了其促成骨机制。转录组学分析表明，HAP的引入可能通过调控PI3K-Akt等关键信号通路，以及影响与细胞粘附、血管生成和ECM组织相关的基因网络，来协同促进骨类器官的发育和矿化。 7. 验证了预制骨类器官在修复大段骨缺损中的有效性。在大鼠颅骨缺损模型中，植入预制的GelMA/AlgMA/HAP骨类器官能显著促进新骨生成和血管化，修复效果优于对照组。 8. 证明了该体系具有良好的生物安全性和可控的体内降解性，具备临床转化潜力。
四、 研究结论与意义
本研究的结论是：利用受天然骨基质启发的GelMA/AlgMA/HAP杂化生物墨水，通过DLP生物打印技术，可以成功构建出大规模、具有自矿化能力、能模拟天然骨组织多细胞组成、微纳结构、机械性能和部分生物学功能的三维骨类器官。
其科学价值在于： * 提出了骨类器官构建的新范式： 强调了模拟骨组织无机/有机杂化ECM微环境对于构建功能化骨类器官的必要性，而不仅仅是细胞的三维聚集。 * 实现了骨类器官性能的突破： 首次报道了具备与天然松质骨可比拟的机械强度和多孔结构的大型骨类器官，并展示了其体内外自矿化和多细胞分化的能力。 * 提供了机制见解： 从转录组层面初步阐释了HAP组分通过激活特定信号通路（如PI3K-Akt）来驱动骨类器官发育和矿化的潜在分子机制。
其应用价值与前景包括： * 疾病建模与药物筛选： 此类具有复杂结构和功能的骨类器官可作为更理想的体外模型，用于研究骨发育、骨代谢疾病（如骨质疏松）、骨肿瘤以及测试相关药物。 * 个性化医疗与再生医学： 未来有望利用患者自身的干细胞，定制化打印“个人专属”的骨类器官，用于修复复杂的骨缺损，避免免疫排斥和供体限制。 * 生物材料评价平台： 为新型骨植入材料或生物材料的生物相容性、成骨活性及骨整合能力评估，提供了一个高度仿生的测试系统。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究还通过组织化学染色（如油红O染色显示脂滴、甲苯胺蓝染色显示糖胺聚糖、TRAP染色显示破骨细胞等）进一步证实了骨类器官内存在脂肪组织、软骨基质成分和破骨细胞活性，表明其成功模拟了骨组织内部的复杂细胞群落和微环境。此外，研究明确对比了纯有机基质（GelMA, GelMA/AlgMA）与无机/有机杂化基质（GelMA/AlgMA/HAP）在促成骨和构建骨类器官能力上的本质差异，突出了无机成分（HAP）不可或缺的关键作用。