本研究由上海交通大学系统生物医学重点实验室的陶生策（Sheng-ce Tao）团队牵头，联合北京大学裴剑锋（Jianfeng Pei）团队、中国科学院上海有机化学研究所董佳佳（Jia-jia Dong）团队等多家单位共同完成。论文于2023年4月6日在线发表于 *Science China Life Sciences*，题为“Specific pupylation as identity reporter (SPIDER) for the identification of protein-biomolecule interactions”。
研究背景方面，蛋白质与生物分子之间的相互作用在几乎所有生物学过程中都扮演关键角色。传统研究方法如免疫共沉淀、GST-pull down、亲和纯化质谱等，由于依赖非共价结合，难以承受严格洗涤条件，容易产生非特异性结果。邻近标记技术如BioID、APEX和Pup-IT虽然能捕捉活细胞中的弱相互作用，但通常需要将目标蛋白与酶融合表达，不适用于特异性修饰的生物分子（如m6A修饰RNA）或小分子，也难以用于不可转染细胞和临床样本。因此，研究者希望开发一种通用、高效且能将非共价结合转化为共价标记的体外方法。
本研究的核心发现是利用结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*）Pup化途径中PafA的底物邻近标记活性。当PupE通过其N端与目标蛋白融合时，PafA能够将PupE共价连接到目标蛋白邻近的蛋白上。基于这一机制，作者设计了SPIDER系统，其关键组分为链霉亲和素与PupE的融合蛋白（SA-PupE）以及PafA。为减少自连和自Pup化，研究者将链霉亲和素表面的赖氨酸突变为精氨酸（得到SAM-PupE），并将PafA表面的七个赖氨酸全部突变为精氨酸（得到PafA7KR）。SAM-PupE保持了与野生型链霉亲和素相当的生物素结合活性和在8 mol/L尿素中的稳定性。SPIDER的基本流程是：将感兴趣的生物分子生物素化作为“诱饵”，与含目标蛋白的样品孵育；加入SAM-PupE和PafA后，PafA将PupE共价连接到诱饵邻近蛋白的赖氨酸残基上；随后利用生物素-琼脂糖在严格条件下（如8 mol/L尿素）富集共价复合物，通过免疫印迹或质谱进行检测或鉴定。
在方法验证阶段，研究者首先用已知的CheA-CheZ蛋白互作模型验证了SPIDER对蛋白-蛋白相互作用的效果。CheA能被生物素化CheZ特异性地连接到SAM-PupE上，而亲和力降低的CheA突变体则信号显著减弱。在蛋白-核酸相互作用方面，SPIDER成功检测了SOX2与其DNA和RNA结合序列的相互作用，以及SARS-CoV-2 N蛋白与其RNA的相互作用。Pup化位点均位于蛋白表面，且SOX2在DNA和RNA结合中的Pup化赖氨酸不同，提示其DNA和RNA结合区域存在差异。在复杂细胞裂解液中，SPIDER直接检测到YTHDF1与生物素化m6A修饰RNA的结合，且该结合可被过量未生物素化m6A竞争抑制。蛋白-小分子相互作用方面，SPIDER从过表达FKBP12的HEK293T细胞裂解液中直接检测到生物素化雷帕霉素与FKBP12的共价复合物，过量雷帕霉素可竞争抑制该反应，Pup化位点K35和K53位于FKBP12-雷帕霉素复合物表面靠近结合位点的区域。与AP-MS、三功能亲和探针、BioID和Pup-IT的平行比较显示，SPIDER在鉴定CheZ相互作用蛋白CheA方面具有更高的特异性和富集效率，且鉴定的Pup化位点数量是Pup-IT的3–4倍。
在应用方面，SPIDER-PNI被用于鉴定m6A结合蛋白。研究者将生物素化m6A修饰单链RNA与过表达YTHDF家族蛋白的HEK293T细胞裂解液孵育，质谱鉴定到20个显著富集的m6A互作蛋白，其中包括已知的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、IGF2BP2和YTHDC1。值得注意的是，YTHDC1在传统生物素化RNA探针实验中未被发现。此外，SPIDER还鉴定出新的潜在m6A结合蛋白SRSF7。表面等离子体共振实验证实SRSF7对m6A修饰RNA的结合亲和力是未修饰RNA的2倍。RIP-seq和m6A-seq分析显示，SRSF7结合的转录本与m6A修饰转录本有584个重叠，且SRSF7结合位点与m6A核心基序GGAC一致，主要富集在编码区、内含子和3′非翻译区附近。
在mRNA相互作用组构建方面，研究者利用生物素化oligo(dT)与THP-1细胞裂解液进行SPIDER实验，在PMA诱导分化前后分别鉴定到121和214个mRNA互作蛋白，总共279个蛋白。与传统oligo(dT) pull-down方法相比，SPIDER更擅长鉴定poly(A)和mRNA 3′-UTR结合蛋白。PMA处理后，108个蛋白显著上调，39个显著下调，其中上调蛋白主要参与mRNA剪接、核糖体生物合成和应激响应。共鉴定到46个剪接因子，提示剪接体动态变化与THP-1分化密切相关。
在蛋白-小分子相互作用方面，SPIDER-PSMI以生物素化来那度胺为诱饵，从HEK293T细胞裂解液中高度富集了已知靶点DDB1-CRBN复合物。Pup化位点均位于蛋白表面靠近结合界面的区域，如DDB1的K204。除CRBN和DDB1外，SPIDER还鉴定到其他来那度胺互作蛋白，这些蛋白与核苷酸切除修复、线粒体翻译和高尔基囊泡运输等通路相关，可能为解释来那度胺的治疗副作用或拓展其应用提供线索。
在酶-底物相互作用方面，SPIDER-PPI用于鉴定大肠杆菌去乙酰化酶CobB的互作蛋白。以生物素化CobB为诱饵，从稳定同位素标记的大肠杆菌裂解液中鉴定到84个互作蛋白，其中一半为已报道的潜在CobB底物，同时发现大量新互作蛋白。生物膜干涉实验验证了随机选取的8个蛋白中5个与CobB直接结合，包括RoxA、RraA、GldA、DksA和VacB。去乙酰化实验进一步证明VacB和DksA在大肠杆菌中可被乙酰化，且CobB能有效去除其乙酰化修饰，提示CobB在转录起始和RNA代谢调控中的新功能。
在配体-受体相互作用方面，SPIDER直接在培养皿中的细胞表面进行反应，首先验证了SARS-CoV-2 S1蛋白与ACE2的结合。随后，研究者将SPIDER与质谱联用，在H1299、Calu-3和Vero E6细胞表面鉴定SARS-CoV-2 RBD的结合蛋白，共获得55个互作蛋白，包括已知受体ACE2和波形蛋白（vimentin）等。生物膜干涉实验进一步确认了RBD和S1与波形蛋白的直接结合。
本研究的结论是，SPIDER是一种基于底物的邻近标记系统，通过酶催化将非共价相互作用转化为共价连接，能够高效、特异地鉴定和验证生物分子-蛋白相互作用，尤其适用于弱、瞬时和膜定位的相互作用。SPIDER具有以下优势：通用性强，只需对目标分子进行生物素化；操作简单，类似AP-MS但更稳健；可进行严格洗涤而不丢失特异性结合；结果可通过凝胶迁移直观观察；关键试剂可标准化和冻干，适合高通量研究。局限性包括非特异性结合不可避免但可通过SILAC策略克服、目前仅适用于体外分析、以及小分子生物素化可能影响其活性。
本研究的亮点在于：首次发现并利用PafA的底物邻近标记活性，开发出唯一基于底物的邻近标记系统；SPIDER在技术上具有高度通用性和鲁棒性；成功应用于多种具有挑战性的相互作用类型，包括m6A修饰RNA、mRNA相互作用组、来那度胺靶点、CobB底物以及细胞表面SARS-CoV-2受体鉴定，并发现了SRSF7作为潜在m6A reader和波形蛋白作为SARS-CoV-2共受体等新结果。