本次介绍的研究由空军军医大学基础医学院免疫学教研室Kun Yang、Dongbo Jiang及Linfeng Cheng等人领导的研究团队完成，成果发表于*NPJ Vaccines*期刊。该研究针对肾综合征出血热，开发并系统评估了三种基于汉滩病毒糖蛋白的新型核酸疫苗候选物，为应对这一重要公共卫生威胁提供了新的疫苗技术平台和策略。

研究背景与目的 肾综合征出血热是一种由汉坦病毒引起、遍布欧亚大陆的严重人畜共患病，以发热、出血倾向和肾功能损害为主要特征，其中汉滩病毒株引起的感染尤为严重，死亡率可达5%至15%。啮齿动物是汉坦病毒的主要自然宿主，人类主要通过接触感染或吸入气溶胶化的排泄物而感染。目前，针对汉坦病毒感染尚无特效治疗方法或有效的抗病毒药物，因此，疫苗接种是预防该疾病最可行的策略。虽然中国和韩国已批准使用基于鼠脑或细胞培养的灭活疫苗，且这些疫苗显示出良好的免疫原性并能有效降低HFRS发病率，但现有研究表明，灭活疫苗需要多次接种才能达到足够的保护效果，且其在老年人和儿童中的安全性仍需进一步验证。

与此同时，核酸疫苗技术，特别是mRNA疫苗在应对新冠疫情中取得了革命性成功，彰显了其作为一种快速、灵活平台的巨大潜力。核酸疫苗能够进入人体细胞并产生内源性抗原，通过双途径呈递给免疫系统，从而激活更强的细胞和体液免疫反应。然而，mRNA疫苗在应对汉滩病毒感染中的效果和适用性仍属未知。此外，脂质纳米颗粒作为高效的抗原递送系统在mRNA疫苗领域已被深入开发，但其在DNA疫苗中的应用潜力，尤其是在对抗各种传染源方面，仍需进一步评估。

基于此，本研究旨在开发针对汉滩病毒糖蛋白的新型核酸疫苗候选物，包括mRNA疫苗、裸DNA疫苗和LNP包裹的DNA疫苗，并在小鼠模型中全面评估其免疫原性和保护效力，同时与已上市的灭活疫苗进行头对头比较，以期为开发更安全、有效的HFRS疫苗提供新的选择和科学依据。

详细研究流程 本研究流程设计严谨，涵盖疫苗构建、体外验证、动物免疫、免疫反应评估、攻毒保护实验以及初步安全性检查等多个环节。

1. 疫苗设计与构建：

   • 抗原选择与序列设计：研究选择汉滩病毒76-118株的M片段作为目标抗原编码序列，该片段编码病毒囊膜糖蛋白。研究者对GP序列进行了密码子优化，并针对不同疫苗平台进行了特异性设计。对于mRNA疫苗，在优化序列的基础上，添加了来源于人β-珠蛋白的5‘和3’非翻译区以及一个120个核苷酸长的poly(A)尾，以增强RNA的稳定性和翻译效率。所有构建体均在C末端添加了3×Flag标签，便于后续检测。
   • 质粒构建与验证：成功构建了DNA疫苗质粒pVAX1-GP_HTNV和用于mRNA体外转录的模板质粒pGEM-UTR-GP_HTNV。所有相关载体均通过Sanger测序和酶切电泳进行验证。
   • mRNA的体外转录与纯化：使用线性化的pGEM-UTR-GP_HTNV质粒作为模板，通过T7 RNA聚合酶进行体外转录，并使用N1-甲基假尿苷-5‘-三磷酸代替尿苷-5’-三磷酸以增强稳定性和降低免疫原性。转录后的mRNA经过加帽、纯化，并通过微流控毛细管电泳验证其纯度和完整性（单一条带，约4000 nt），dsRNA残留含量仅为0.07%。
   • 脂质纳米颗粒制备：采用微流控聚焦策略制备了包裹DNA的LNP。脂质成分包括可离子化脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质。制备的DNA-LNP平均粒径为98.83纳米，包封效率超过70%，透射电镜显示颗粒呈均匀的实心球形。mRNA则使用商业化的体内转染试剂形成mRNA-Lipojet复合物，平均粒径为144.57纳米。

2. 体外表达验证：

   • 将构建的DNA、DNA-LNP和mRNA分别转染HEK293T细胞。
   • 蛋白质印迹：转染24小时后，使用针对Flag标签的抗体进行检测。由于GP的N端GN亚基在表达过程中会发生自噬降解，因此只能检测到分子量约为61 kDa的GC蛋白条带，证实了抗原蛋白的正确表达。
   • 定量实时PCR：通过qPCR检测转染细胞中GN和GC的转录水平，结果显示两者之间没有实质性差异，表明DNA和mRNA均能被细胞有效摄取并转录。
   • 免疫荧光：免疫荧光显微镜观察显示，HTNV GP蛋白在转染细胞的细胞质中成功表达并定位。

3. 动物免疫与免疫原性评估：

   • 动物与分组：使用6周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为6组：PBS对照组、空LNP对照组、灭活疫苗组、裸DNA疫苗组、DNA-LNP疫苗组和mRNA-Lipojet疫苗组，每组21只。
   • 免疫方案：所有小鼠在0天和28天通过肌肉注射接受两剂次疫苗接种。灭活疫苗剂量为10微克，DNA和DNA-LNP疫苗含有30微克DNA，mRNA-Lipojet疫苗含有10微克mRNA。在第182天，所有组别接受一次同剂量的加强免疫以评估长期免疫反应。
   • 体液免疫反应评估：
     • 特异性IgG抗体：通过ELISA定期检测血清中HTNV特异性IgG抗体滴度。结果显示，初次免疫后，所有候选疫苗组均能诱导产生抗原特异性IgG抗体，其中DNA-LNP组在初免后的抗体滴度显著高于灭活疫苗组。在长期观察中，所有疫苗诱导的抗体滴度在接种后5个月内仍维持在较高水平。
     • 中和抗体：采用固定病毒-稀释血清法检测血清中的HTNV中和抗体。两剂次免疫后，DNA-LNP组诱导的平均中和抗体滴度最高，显著高于灭活疫苗组和裸DNA组。加强免疫后，所有候选疫苗组的中和抗体水平均显著高于对照组，且核酸疫苗的体液免疫反应不劣于临床使用的灭活疫苗。
   • 细胞免疫反应评估：
     • ELISpot检测：在免疫后特定时间点取小鼠脾细胞，使用10条HTNV GP的15聚体混合肽刺激，通过ELISpot检测分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴细胞。结果显示，所有候选疫苗均能显著诱导GP特异性的IFN-γ分泌细胞（Th1型反应）。重要的是，裸DNA、DNA-LNP和mRNA-Lipojet疫苗诱导的IFN-γ分泌细胞水平均显著高于灭活疫苗。DNA-LNP还比裸DNA诱导了更强的IFN-γ反应，表明LNP递送增强了DNA疫苗的细胞免疫。在长期免疫反应中，核酸疫苗仍主要诱导Th1型反应，而灭活疫苗则表现出Th2偏向性。
     • 流式细胞术分析：进一步通过流式细胞术分析了细胞因子分泌和记忆T细胞表型。结果显示，所有候选疫苗均能显著增加CD4+和CD8+ T细胞分泌IFN-γ和IL-2。mRNA-Lipojet疫苗组还诱导了更高水平的颗粒酶B分泌，表明增强了细胞毒性活性。此外，所有疫苗组均能诱导病毒特异性的CD4+效应记忆T细胞。
     • 优势表位鉴定：通过单肽刺激ELISpot实验，鉴定了两个关键的优势T细胞表位肽段：SYCMTGVLIEGKCFV和KKVMATIDSFQSFNT，这两个表位在即时和长期免疫反应中均能引发强烈的T细胞应答。
   • 转录组学分析：
     • 对免疫后小鼠的脾细胞进行RNA测序，通过KEGG和GO通路富集分析揭示不同疫苗策略的免疫激活机制。分析表明，所有候选疫苗方案均有效激活了体内的免疫反应，富集通路涉及免疫激活、淋巴细胞功能、Th细胞亚群分化、炎症反应调控等。DNA-LNP组相比裸DNA组显示了更多免疫相关通路的增强。

4. 体内保护效力评估：

   • 攻毒模型：在初次免疫后第53天，每组取6只小鼠，通过肌肉注射攻击5×10^5 PFU的HTNV 76-118病毒株。
   • 病毒载量检测：攻击后第3天处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾等主要器官，通过qPCR检测病毒RNA拷贝数。结果显示，与对照组相比，所有四种候选疫苗免疫组小鼠的心脏和肝脏中的病毒RNA水平均显著降低。此外，DNA-LNP和mRNA-Lipojet疫苗组的脾脏病毒RNA水平也显著低于对照组。
   • 免疫组织化学：对心脏和肝脏组织进行免疫组化染色，检测HTNV核蛋白表达。结果显示，PBS和空LNP对照组小鼠的心肝组织中存在大量NP阳性细胞，而所有候选疫苗免疫组小鼠组织中仅检测到极少量的阳性细胞。这表明两剂次疫苗接种可以有效预防HTNV在体内的复制，且三种核酸疫苗表现出与灭活疫苗相当的体内保护效力。

5. 初步安全性评估：

   • 在长期免疫后，收集小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、大脑和腓肠肌进行H&E染色病理学检查。
   • 结果显示，四个候选疫苗组与对照组小鼠的组织之间未观察到显著的病理学差异，初步证实了这些候选疫苗在小鼠体内未造成病理损伤，具有初步的安全性证据。

主要研究结果 本研究取得了一系列系统性成果： 1. 成功构建并表征了三种新型核酸疫苗平台：包括能高效表达HTNV GP的裸DNA疫苗、LNP递送的DNA疫苗以及经过核苷修饰的mRNA疫苗，并证实了它们在体外细胞中的有效表达。 2. 核酸疫苗诱导了强大且持久的免疫反应： * 体液免疫：DNA-LNP疫苗诱导了最高水平的中和抗体，其滴度显著高于灭活疫苗和裸DNA疫苗。所有核酸疫苗的长期体液免疫水平均与灭活疫苗相当。 * 细胞免疫：三种核酸疫苗均成功诱导了以Th1型反应为主的、HTNV特异性的细胞免疫反应，其强度（尤其是IFN-γ分泌）显著优于灭活疫苗。mRNA疫苗还诱导了更强的细胞毒性活性。 3. 核酸疫苗提供了有效的体内保护：在HTNV攻毒模型中，所有候选疫苗（包括三种核酸疫苗和灭活疫苗）均能显著降低主要器官（尤其是心脏和肝脏）的病毒载量，并提供可比的保护效力，其中DNA-LNP和mRNA-Lipojet在降低脾脏病毒载量方面表现更优。 4. 揭示了不同疫苗平台的免疫学特点： * DNA-LNP：相比裸DNA，LNP递送系统显著增强了DNA疫苗的体液和细胞免疫反应，表明LNP不仅是mRNA的有效递送工具，也能优化DNA疫苗的效能。 * mRNA-Lipojet：诱导了最强的Th1型细胞免疫和细胞毒性反应。 * 与传统灭活疫苗比较：核酸疫苗在诱导Th1型细胞免疫方面具有明显优势，而灭活疫苗在长期免疫后更倾向于Th2型反应。在关键的保护性指标——中和抗体水平和体内病毒清除上，优质核酸疫苗平台（如DNA-LNP）可以达到甚至超越灭活疫苗的水平。 5. 鉴定了关键免疫优势表位：发现了SYCMTGVLIEGKCFV和KKVMATIDSFQSFNT两个GP来源的T细胞优势表位，为未来开发基于表位的疫苗提供了候选靶点。 6. 提供了初步的安全性数据：动物实验未发现疫苗相关的显著病理损伤，支持了进一步开发的潜力。

结论与意义 本研究成功开发并全面评估了针对汉滩病毒的三种新型核酸疫苗候选物。研究结论表明： 1. 科学价值：首次系统比较并证实了DNA疫苗、mRNA疫苗与灭活疫苗在预防汉坦病毒感染中的免疫学特征和效力差异。研究发现核酸疫苗，特别是采用先进递送技术（如LNP）的核酸疫苗，能够诱导优于或等同于传统灭活疫苗的免疫保护，同时在激活Th1型细胞免疫方面具有独特优势。这为理解不同疫苗技术平台的免疫机制提供了重要数据。 2. 应用价值：本研究标志着在开发汉滩病毒核酸疫苗方面迈出了重要一步。研究结果提示，采用DNA和mRNA疫苗进行序贯免疫有可能进一步放大核酸疫苗的优势。所开发的疫苗平台，尤其是mRNA-Lipojet和DNA-LNP，为应对汉坦病毒这一重大病毒威胁提供了有价值的补充和新的技术选择，有望在未来满足不同人群的特定需求，并快速应对全球卫生紧急事件。 3. 重要观点：研究强调，在应对像HFRS这样的重要传染病时，并行开发多种疫苗技术至关重要。这不仅能为防控提供更多选择，也能增强应对新病原体及其变异的综合能力。

研究亮点 1. 开创性：这是首次针对出血热病毒（汉坦病毒）开发并报告mRNA疫苗的研究，也是首次全面系统地比较DNA、mRNA和灭活疫苗在抗汉坦病毒感染中的免疫效力的研究。 2. 技术先进性：采用了当前最前沿的核酸疫苗技术，包括核苷修饰的mRNA和用于DNA疫苗递送的新型可离子化脂质纳米颗粒技术，并进行了深入的优化和表征。 3. 评估系统性：研究设计非常全面，不仅评估了即时和长期的体液与细胞免疫反应，还通过转录组学分析了免疫激活机制，并最终在严格的攻毒模型中验证了保护效力，形成了完整的证据链。 4. 发现重要性：明确了不同核酸疫苗平台相对于传统灭活疫苗的免疫学优势（如DNA-LNP的强体液免疫、mRNA的强细胞免疫），并鉴定了关键T细胞表位，为未来疫苗设计和优化指明了方向。 5. 转化潜力：研究结果为将成功的核酸疫苗技术平台拓展至其他重要但缺乏理想疫苗的传染病领域（如其他血清型的汉坦病毒感染）提供了概念验证和可行性依据。