一项关于弓形虫钙信号调控机制的重大发现：蛋白激酶A的负向调控作用

由Alessandro D. Uboldi等来自澳大利亚沃尔特与伊丽莎·霍尔医学研究所、墨尔本大学、清华大学医学院、英国剑桥大学、法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学、澳大利亚国立大学等多国研究机构的研究人员共同完成的一项原创性研究，于2018年9月12日发表在PLOS Biology期刊上。论文标题为“Protein kinase A negatively regulates Ca2+ signalling in Toxoplasma gondii”。

本研究聚焦于顶复门（Apicomplexa）重要寄生虫——刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）的致病机制核心环节：寄生虫如何感知宿主环境，精准调控其运动、入侵与复制之间的转换。研究背景在于，已知胞质钙离子浓度（[Ca2+]cyt）的升高是激活寄生虫运动（滑行运动，gliding motility）、入侵宿主细胞和从宿主细胞中逸出（egress）的关键信号。然而，当入侵完成，寄生虫需要在宿主细胞内建立一个稳定的复制环境时，这个强烈的Ca2+信号是如何被迅速关闭的，这一机制此前并不清楚。虽然细胞外高钾（[K+]）和低pH（[H+]）环境被发现可以抑制或激活运动，但跨膜信号转导的具体通路尚属未知。在其他真核生物中，环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）依赖的蛋白激酶A（Protein Kinase A, PKA）是响应环境刺激（通常通过G蛋白偶联受体GPCRs）的核心信号分子。然而，顶复门寄生虫基因组中缺乏典型的GPCRs，使得cAMP/PKA通路在此类生物中的功能充满谜团。基于此，本研究旨在探究弓形虫中cAMP/PKA信号是否以及如何参与调控Ca2+信号，从而控制寄生虫在入侵宿主细胞后从运动状态向复制状态的转换。

研究流程系统而深入，可分为多个相互衔接的实验阶段：

第一阶段：目标激酶的定位与互作蛋白鉴定。 研究人员首先选择弓形虫三个PKA催化亚基（catalytic subunit）同源物中最保守且在速殖子（tachyzoite）阶段表达的PKAC1（TgME49_226030）作为研究对象。他们利用基因工程技术，构建了一个条件性敲低（conditional knockdown， cKD）细胞系：将PKAC1基因置于四环素关闭（tet-off）系统控制下，并在其N端添加HA表位标签。通过免疫荧光（Immunofluorescence assay, IFA）发现，PKAC1定位于寄生虫外周，与内膜复合物（Inner Membrane Complex， IMC）标记蛋白IMC1共定位。进一步通过抗HA标签的免疫共沉淀结合质谱分析（mass spectrometry），鉴定出与PKAC1特异性相互作用的唯一蛋白是预测的PKA调节亚基（regulatory subunit），将其命名为PKAR1（TgME49_242070）。研究发现，PKAR1的N端具有典型的豆蔻酰化和棕榈酰化位点（Gly2， Cys5， Cys7），这些脂质修饰是将其锚定在膜上的关键。通过将PKAR1 N端前15个氨基酸与绿色荧光蛋白（GFP）融合并突变这些位点，证实了双酰化修饰对于PKAR1（以及通过其结合的PKAC1）定位于寄生虫外周膜结构是必需的。这揭示了弓形虫PKA复合物通过调节亚基的脂质修饰定位在细胞膜附近，而非像后生动物那样通过与A激酶锚定蛋白（AKAPs）相互作用来定位。

第二阶段：PKAC1功能缺失的表型分析。 当使用脱水四环素（anhydrotetracycline, ATC）处理PKAC1 cKD寄生虫，有效敲低PKAC1蛋白表达后，研究人员观察到其生长周期出现严重缺陷。斑块试验（plaque assay）显示，PKAC1缺陷型寄生虫形成的斑块显著减小。更为奇特的是，体外培养24小时后，宿主细胞大量裂解、脱落，而细胞内几乎看不到寄生虫。这暗示PKAC1的缺失可能导致寄生虫无法在宿主细胞内稳定留存。

第三阶段：揭示“入侵后立即逸出”的奇特表型及其机制。 为了精确定位缺陷发生的环节，研究团队进行了双色入侵实验和活细胞成像。静态入侵实验表明，PKAC1缺陷型寄生虫在入侵10分钟后，成功进入宿主细胞的数目显著减少。活细胞成像捕捉到了令人震惊的现象：PKAC1缺陷型寄生虫能够像正常寄生虫一样附着、激活运动、穿过宿主细胞膜并形成典型的移动连接（moving junction），看似成功入侵。然而，在入侵完成后的短时间内（平均约200秒），宿主细胞便开始崩解，寄生虫重新激活运动并从中逸出。这种“早产”的逸出表型与正常的、在复制周期结束时发生的程序性逸出截然不同。

为了探究这种过早逸出的机制，研究人员首先排除了PKAC1在入侵过程本身（如运动、附着、微线体（microneme）分泌、移动连接形成、纳虫空泡膜（Parasitophorous Vacuole Membrane， PVM）形成）中起直接作用的可能性。通过一系列实验（包括测量入侵速度、RON4蛋白标记的移动连接形成、细胞松弛素D诱导的“空泡”形成实验、以及使用表达膜结合tdTomato的宿主细胞实时观察PVM形成），他们证实PKAC1缺陷并不影响这些早期入侵步骤。

随后，研究聚焦于已知在寄生虫逸出中起关键作用的穿孔素样蛋白1（Perforin-like protein 1， PLP-1）。PLP-1具有溶细胞活性，其激活依赖于纳虫空泡的酸化。研究人员在PKAC1 cKD背景下敲除了PLP-1基因（PKAC1 cKD/ΔPLP1）。结果显示，缺失PLP-1可以部分“挽救”PKAC1缺失的表型：宿主细胞不再快速崩解，细胞内能够观察到复制的寄生虫。同样，使用质子泵抑制剂DCCD处理以抑制空泡酸化，也能阻止PKAC1缺陷型寄生虫的过早逸出。这些结果证明，PKAC1缺陷导致的过早逸出，依赖于PLP-1的溶细胞活性和空泡酸化过程，表明PKAC1的正常功能是入侵后抑制逸出程序的关键。

第四阶段：PKAC1调控胞质钙离子动态的核心发现。 既然Ca2+信号是运动与逸出的核心触发器，研究人员推测PKAC1可能通过负向调控[Ca2+]cyt来抑制逸出。他们利用基因编码的钙离子探针GCaMP6（与mCherry共表达）实时监测入侵过程中的[Ca2+]cyt变化。在正常（PKAC1表达）的寄生虫中，入侵完成后，[Ca2+]cyt在10-20秒内迅速从峰值下降到基线水平（约峰值的35%）。然而，在PKAC1缺陷型寄生虫中，这种入侵后的快速“淬灭”现象消失了。[Ca2+]cyt在入侵后持续波动，保持在较高水平，平均需要约150秒才能降至基线。进一步分析发现，那些最终发生逸出的PKAC1缺陷型寄生虫，在入侵后100秒时[Ca2+]cyt水平显著高于未逸出者或正常对照。

更重要的是，即使在缺失PLP-1或使用DCCD抑制酸化的条件下（此时寄生虫不再逸出），PKAC1缺陷导致的[Ca2+]cyt淬灭缺陷依然存在。这表明PKAC1对[Ca2+]cyt的负调控作用是独立于PLP-1的溶细胞活性的上游事件，高[Ca2+]cyt可能进而触发了PLP-1依赖的逸出程序。

第五阶段：PKAC1负调控基础钙水平和cGMP信号通路。 为了更深入理解PKAC1如何调控Ca2+信号，研究团队检测了其在细胞外环境中的作用。使用Fura-2钙离子染料进行群体荧光测量发现，在无钙缓冲液中，PKAC1缺陷型寄生虫的基础[Ca2+]cyt水平（约58 nM）显著高于正常寄生虫（约33 nM）。利用流式细胞术（FACS）分析表达GCaMP6的寄生虫，也证实了在模拟细胞内环境（高钾）的缓冲液中，PKAC1缺陷导致基础[Ca2+]cyt升高。

由于已知环磷酸鸟苷（cyclic GMP， cGMP）信号通路能正调控弓形虫和疟原虫的Ca2+信号，研究人员探索了PKAC1与cGMP通路之间的功能联系。他们使用磷酸二酯酶抑制剂BIPPO来升高细胞内cGMP水平，并通过FACS监测GCaMP6的响应。结果显示，PKAC1缺陷型寄生虫对BIPPO诱导的[Ca2+]cyt升高表现出更强的敏感性，即达到相同响应程度所需的BIPPO浓度更低。而使用钙离子载体A23187直接升高[Ca2+]cyt时，则无此差异。这提供了PKAC1通过负调控cGMP信号通路来间接抑制Ca2+信号的直接功能证据。

本研究的主要结论是： 弓形虫的cAMP依赖性蛋白激酶A催化亚基1（PKAC1）在宿主细胞入侵完成后，发挥关键的“刹车”作用。它通过负向调控胞质钙离子浓度（可能部分通过抑制cGMP信号通路），迅速关闭由Ca2+驱动的运动与逸出信号，从而使寄生虫能够顺利过渡到稳定的细胞内复制阶段。PKAC1功能的缺失导致Ca2+信号无法关闭，进而异常激活PLP-1依赖的溶细胞途径，致使寄生虫在刚入侵后便过早逸出，无法建立有效感染。

本研究的科学价值与应用意义重大： 首先，它首次在弓形虫乃至整个顶复门寄生虫中，揭示了一个具体分子（PKAC1）是如何调控入侵后“运动关闭”这一关键生物学转换的，解答了该领域长期存在的核心问题。其次，它将cAMP/PKA、cGMP和Ca2+这三个重要的第二信使通路在寄生虫中功能性地联系起来，构建了一个更完整的信号转导网络框架。第三，研究发现了弓形虫PKA通过调节亚基的独特脂质修饰（而非经典的AKAP锚定）进行定位，拓展了对PKA在不同生物中多样性功能机制的理解。第四，PKAC1作为连接环境感知（可能是通过非典型受体或离子敏感腺苷酸环化酶）与细胞内行为执行的关键节点，为开发针对寄生虫入侵和宿主转换阶段的新型干预策略（如药物靶点）提供了极具潜力的研究方向。

本研究的亮点在于： 1. 发现了一个全新的生物学表型： 精确揭示了PKAC1缺失导致“入侵后立即逸出”这一此前未知的现象。2. 巧妙的实验设计： 综合运用了条件性基因敲低、活细胞钙成像、遗传互作（PKAC1/PLP-1双敲）、药理干预、多组学（蛋白质组学）等多种先进技术，从表型到机制进行了层层深入、逻辑严密的解析。3. 建立了清晰的因果关系链： 成功将PKAC1功能缺失、[Ca2+]cyt淬灭缺陷、PLP-1依赖性宿主细胞损伤这三个事件串联起来，并明确了上游（钙信号）与下游（溶细胞效应）的关系。4. 提供了跨通路调控的证据： 不仅证明了PKAC1负调控Ca2+，还通过功能性实验将其与cGMP信号通路联系起来，深化了对寄生虫信号网络复杂性的认识。

此外，研究还在讨论部分与同期另一项关于弓形虫PKA的研究（Jia et al.）进行了呼应和互补，共同强化了cAMP/PKA在负调控逸出中的核心作用，并提出了未来利用cAMP生物传感器直接监测寄生虫内cAMP动态变化的重要方向。本研究为理解顶复门寄生虫的感染生物学和信号转导机制树立了新的范式。