本研究由Laurel Romano、Katie G. Seu、Julien Papoin等学者共同完成，第一作者和通讯作者分别来自辛辛那提儿童医院医学中心血液科和分子医学系、范斯坦医学研究所分子医学研究所发育性红细胞生成实验室等多个研究机构。这项研究成果于2022年10月6日发表于血液学领域的重要期刊*Blood*（第140卷第14期）。
学术背景 本研究的核心科学领域是造血生物学，具体聚焦于骨髓中的造血微环境——红细胞岛。自1958年Marcel Bessis首次描述以来，红细胞岛（Erythroblastic Island, EBI）一直被认为是终末红细胞生成的主要场所。它由一个中央巨噬细胞被多个不同成熟阶段的红系前体细胞（成红细胞）围绕而形成。巨噬细胞为红细胞生成提供生长因子、铁元素，并吞噬脱出的细胞核，对于高效的红细胞生成至关重要。然而，尽管经过了数十年的研究，红细胞岛的确切细胞组成、其巨噬细胞的异质性以及该微环境在病理条件下的动态变化仍不完全清楚。此外，许多影响红细胞生成的疾病，如地中海贫血、先天性红细胞生成异常性贫血、骨髓增生异常综合征以及广泛存在的炎症性贫血（Anemia of Inflammation, AOI），其缺陷都发生在红细胞岛内的终末红细胞成熟阶段。因此，深入解析红细胞岛的功能组成和调控机制，对于理解正常和病态造血、开发新的治疗策略具有迫切的科学意义和临床价值。本研究旨在利用先进的多光谱成像流式细胞术、体外重构和单细胞测序等技术，重新审视并精确描绘红细胞岛的细胞构成，探究其在稳态和应激条件下作为造血微环境的功能，特别是在协调红细胞和粒细胞生成平衡方面的作用。
详细工作流程 本研究采用了多层次、多技术的综合研究策略，工作流程严谨而系统，主要包括以下几个关键步骤：
红细胞岛的富集与初步表征：首先，研究人员从小鼠股骨和胫骨中获取完整的骨髓细胞悬液。为了高效分离天然存在的细胞簇（即红细胞岛），他们采用了一种非抗体依赖性的重力沉降法。将骨髓细胞悬液铺在含有不同浓度牛血清白蛋白（0%、1.5%、3%）的密度梯度液上。沉降30分钟后，细胞簇和单个细胞会根据大小和密度分层。含有最密集细胞簇的3% BSA层被收集，这个部分被证实富含红细胞岛。通过成像流式细胞术分析发现，该部分不仅显著富集成红细胞，还出乎意料地富集了粒细胞前体细胞，而成熟的网织红细胞、红细胞以及淋巴细胞则被有效去除。这一发现是后续研究的起点。
成像流式细胞术进行定量与空间关系分析：这是本研究的关键技术之一。研究人员将富集到的细胞簇固定、染色后，使用ImageStreamX成像流式细胞仪进行分析。他们不仅基于表面标志物（如F4/80标记巨噬细胞，CD71标记转铁蛋白受体阳性的成红细胞，CD11b标记粒细胞），更重要的是，通过直接可视化观察细胞簇的形态，手动筛选出符合“中央F4/80+巨噬细胞被至少3个CD71+成红细胞紧密环绕”这一经典定义的红细胞岛事件。创新性地，他们对每个红细胞岛事件中CD11b阳性区域的面积和CD71阳性区域的面积进行了精确量化，并计算两者的比例（斜率）。这种方法允许对红细胞岛内不同细胞谱系的相对丰度进行客观、定量的评估，而不仅仅是定性的描述。他们还在体内通过整块骨髓的共聚焦免疫荧光成像，证实了CD11b+细胞在体内就与红细胞岛巨噬细胞紧密接触，排除了分离过程造成人为相互作用的可能性。通过混合实验（将野生型红细胞岛与GFP标记的骨髓细胞混合），也证明了CD11b+细胞不会在体外处理过程中随机附着到红细胞岛上，进一步确认了其是红细胞岛的天然组分。
单细胞RNA测序解析细胞组成与异质性：为了无偏倚地、系统地鉴定红细胞岛内的所有细胞类型及其转录状态，研究人员对从富集细胞簇中解离出来的单个细胞进行了单细胞RNA测序。他们设计了两种策略：一种是直接对未经分选的细胞进行测序（以捕获全部成分），另一种是先通过流式分选出CD71+（成红细胞）、CD11b+（粒细胞）和F4/80+（巨噬细胞）三个群体分别进行测序（以深度解析主要组分）。测序在10x Genomics平台上完成。数据分析通过迭代聚类和引导基因选择等生物信息学方法进行。这一技术揭示了红细胞岛是一个转录学上高度多样化的微环境：除了预期的成红细胞（占约41-43%）和巨噬细胞外，粒细胞前体细胞占了相当大的比例（约31-38%）。对分选群体的分析清晰地展示了红系终末分化的连续状态（从早期到晚期成红细胞）以及粒系分化的各个阶段（从早幼粒细胞到接近成熟的粒细胞）。尤为重要的是，研究揭示了F4/80+巨噬细胞群体内部存在显著的异质性，并非一个均一的群体，这解释了为何过去基于单一或组合表面标志物来定义红细胞岛巨噬细胞的研究存在不一致性。
利用病理生理学模型探究微环境的动态平衡：基于发现红细胞岛内同时存在红系和粒系前体，研究团队提出一个核心假设：红细胞岛作为一个共同微环境，可能调节着红细胞生成和粒细胞生成之间的平衡。为了验证这一假设，他们设计了一系列体内实验模型，并用成像流式细胞术量化红细胞岛内两种细胞的比例变化。
CITE-seq技术深度剖析红细胞岛巨噬细胞：为了克服传统流式对高自发荧光巨噬细胞分选的困难，并同时获取转录组和表面蛋白组信息，研究人员采用了前沿的CITE-seq技术。他们重点分析了EPO刺激后和对照小鼠的红细胞岛富集样本，并通过负向磁珠分选进一步富集巨噬细胞。CITE-seq数据通过CellHarmony等工具进行分析，成功鉴定了28个转录组不同的细胞群体。其中，第9号细胞簇被鉴定为经典的红细胞岛巨噬细胞，表达已知的标志物如Hmox1、Mertk、Siglec1，并在表面携带F4/80和VCAM1蛋白。重要的是，EPO刺激后，该群体细胞数量增加了5倍，与成像流式观察到的红细胞岛总数增加相吻合。分析还揭示了巨噬细胞群体内部（包括第9簇内）在转录和表面标志物表达上的高度异质性和可塑性。例如，第9簇巨噬细胞中EPO受体的表达稀疏且不均一，提示其对EPO的反应可能不完全是细胞自主性的，或涉及细胞间膜交换等机制。同时，这些巨噬细胞同时表达了通常与M1型（促炎，如CD86）和M2型（抗炎/修复，如CD163、MRC1）相关的标志物，表明其功能复杂，不适合用简单的M1/M2二分法来界定。
主要结果 本研究获得了一系列相互印证、逻辑递进的发现： 1. 红细胞岛包含粒细胞前体：通过重力沉降富集、成像流式定量和共聚焦成像，确凿证明CD11b+细胞是红细胞岛的固有组分，它们在体内外均与中央巨噬细胞紧密接触。流式分析进一步显示，富集部分特异性地富集了早幼粒细胞、中幼粒细胞等不成熟的粒细胞前体，而耗竭了成熟的中性粒细胞。这首次明确揭示了红细胞岛也是一个粒细胞生成的场所，因此作者提出应将其更准确地称为“红细胞-粒细胞岛”（Erythro-Myeloblastic Island, EMBI）。 2. 单细胞转录组证实双谱系共存与巨噬细胞异质性：scRNA-seq数据为上述发现提供了无偏倚的转录组证据。红细胞岛内三大主要细胞类型为成红细胞、粒细胞前体和巨噬细胞。对F4/80+细胞的分析证实了巨噬细胞的高度异质性，存在多个亚群，这可能对应于支持不同类型/比例造血前体细胞的微环境。 3. 红细胞岛作为红/粒系生成平衡的调控枢纽：一系列体内模型实验的成像流式数据有力地支持了这一核心结论。当机体需要更多粒细胞时（G-CSF刺激、炎症状态），红细胞岛内粒细胞前体比例上升，挤压红细胞生成空间，导致贫血；当粒细胞生成缺陷时（Gfi1-/-），红细胞生成相对增强；当需要大量红细胞时（EPO刺激），不仅岛内成红细胞扩增，连支持它们的巨噬细胞数量也同步增加。这动态地证明了红细胞岛中央巨噬细胞像一个“支点”，能够适应不同的生理病理需求，优化红细胞或中性粒细胞的产出。 4. 红细胞岛巨噬细胞的深度分子图谱：CITE-seq成功绘制了红细胞岛相关巨噬细胞的高分辨率分子图谱。鉴定出的第9簇经典红细胞岛巨噬细胞在EPO刺激下数量大幅增加，但转录组在刺激前后没有显著差异，提示其功能可能已处于支持红细胞生成的“优化”状态，应激时主要通过增加数量而非改变特性来应对。同时，数据清晰展示了该群体在标志物表达上的异质性，如CSF1R表达广泛但非特异，CX3CR1表达不均等，这解释了以往使用单一标志物追踪巨噬细胞面临的挑战。所有数据已构建成可交互的在线查看器，供领域内研究人员深入挖掘。
结论与意义 本研究的结论是：骨髓中的红细胞岛是一个“双重身份”的微环境，它不仅支持终末红细胞生成，也支持终末粒细胞生成，因此应被视为“红细胞-粒细胞岛”。中央巨噬细胞具有高度的异质性和可塑性，它们作为造血生态位，能够动态调节红细胞生成和粒细胞生成之间的平衡，以适应稳态和各种病理生理状态（如炎症、应激）的需求。 这项研究的科学价值重大：它革新了我们对经典造血微环境——红细胞岛的理解，将其从一个“专属”的红系生境重新定义为红系和粒系共享并竞争的“公共”生态位。这为理解造血谱系命运决定、细胞间相互作用以及骨髓微环境的整体调控提供了全新的视角。其应用价值尤为突出：研究首次在细胞微环境水平上，将炎症性贫血的发病机制与红细胞岛内平衡向粒细胞生成的倾斜直接联系起来，为开发针对炎症性贫血（而不仅仅是补充EPO或铁剂）的新型治疗策略提供了潜在的靶点——即调控红细胞岛微环境本身的平衡。此外，所提供的巨噬细胞单细胞分子图谱是未来深入研究该生态位的宝贵资源。
研究亮点 本研究的亮点在于：1) 重要发现：首次确证红细胞岛是粒系终末分化的场所，并阐明其作为红/粒系平衡动态调节枢纽的功能。2) 技术创新与整合：创新性地将成像流式细胞术的形态定量分析与scRNA-seq、CITE-seq等前沿单细胞组学技术相结合，实现了从空间表型到分子图谱的多维度、高分辨率解析。特别是利用成像流式对每个红细胞岛内不同谱系面积进行精确定量，为功能研究提供了强有力的量化工具。3) 研究策略的系统性：从现象发现（CD11b+细胞存在）到组分鉴定（单细胞测序），再到功能验证（多种体内模型），最后到机制探索（巨噬细胞分子分型），逻辑链条完整，证据环环相扣。
其他有价值内容 作者在讨论中也坦率地指出了研究的局限性，例如通过重力沉降法富集的3% BSA层中可能混杂了其他类型的骨髓细胞簇；尽管采取了强力解离和负向富集，CITE-seq样本中仍可能存在因细胞膜碎片交换或残留被吞噬细胞内容物造成的“污染”信号。这些坦诚的讨论为后续研究的改进指明了方向。此外，研究暗示红细胞岛巨噬细胞对EPO的反应可能涉及非细胞自主性机制（如通过膜交换获得EPOR功能），这是一个值得未来深入探索的有趣方向。