单细胞骨髓间充质干细胞来源的软骨类器官通过天然血管微环境梯度实现异质性骨软骨再生研究

作者及发表信息
本研究由Zhenying Chen（东南大学中大医院）、Qitao Bo和Chao Wang（同济大学附属上海市肺科医院）、Yong Xu（同济大学/成都医学院第二附属医院）、Xiang Fei和Ru Chen（海南医学院附属海南医院）共同完成，发表于Journal of Nanobiotechnology 2025年第23卷第325期。

学术背景
骨软骨缺损（Osteochondral Defects, OCDs）因软骨层（无血管）、钙化软骨层（过渡区）和软骨下骨层（高度血管化）的微环境异质性，再生修复面临重大挑战。传统方法（如微骨折术、干细胞移植）难以重建天然梯度结构。本研究提出利用单细胞骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Stem Cells, BMSCs）构建软骨类器官（Cartilage Organoids），通过模拟天然血管化梯度微环境，实现软骨与骨的同步再生。

研究流程

1. BMSCs的分离与鉴定

   • 样本：18只6月龄新西兰白兔髂骨骨髓，分离P0-P7代BMSCs。
     
   • 方法：流式细胞术检测表面标志物（CD29/CD44为阳性，CD34/CD45为阴性），并通过成骨（茜素红染色）和成软骨（阿尔新蓝染色）诱导评估分化潜能。
     
   • 关键发现：P3代BMSCs干细胞特性最佳（CD29/CD44高表达，CD34/CD45阴性），选择用于后续实验。

2. 软骨类器官的构建

   • 3D培养系统：设计光刻法制备的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔阵列（直径200 μm，深150 μm），填充3%琼脂糖形成非粘附性微环境。
     
   • 分化诱导：将P3 BMSCs接种于微孔中，使用含TGF-β3的成软骨培养基培养28天，形成直径约190 μm的类器官。
     
   • 验证：免疫荧光显示COL2A1和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）表达显著升高，3D培养比2D培养更有效维持细胞活性和软骨基质分泌。

3. 血管微环境对类器官分化的调控

   • 体外实验：将类器官分为三组：对照组（无VEGF）、VEGF组（5 ng/mL VEGF）、抗血管组（Axitinib）。
     
   • 结果：VEGF促进肥大化基因（COL10A1/MMP13）表达，抑制软骨标志物（SOX9/COL2A1）；Axitinib则相反。RNA测序显示VEGF上调血管生成（VEGFA/ANGPT1）和成骨（RUNX2）通路，下调软骨相关通路（TGF-β/Wnt）。

4. 体内异质性再生验证

   • 裸鼠皮下植入：将类器官/明胶甲基丙烯酰（GelMA）复合物（含/不含Axitinib）植入裸鼠背部。4周后，无Axitinib组形成骨组织（微CT显示骨小梁增加），含Axitinib组保留软骨特性（GAG/COL2高表达）。
     
   • 兔OCD模型：植入类器官/GelMA圆柱体至膝关节缺损处。12周后，缺损区上层形成透明软骨，下层再生软骨下骨，过渡区呈现天然梯度结构（H&E和番红O染色证实）。

主要结果
1. BMSCs特性：P3代细胞兼具高纯度和多向分化潜能（成骨/成软骨）。
2. 类器官构建：3D微环境显著提升细胞增殖和软骨基质沉积（COL2/DNA比值较2D提高3倍）。
3. 血管调控机制：VEGF通过激活Notch1信号促进肥大化，而Axitinib抑制血管生成以维持软骨表型。
4. 动物模型：类器官在天然梯度微环境中分化为软骨（上层无血管）和骨（下层血管化），ICRS评分较对照组提高80%。

结论与价值
本研究首次提出“单类器官双分化”策略，利用天然血管梯度微环境指导BMSCs类器官实现骨软骨一体化再生。其科学价值在于：
1. 方法创新：结合光刻技术构建高通量类器官培养平台，突破传统组织工程的层状结构限制。
2. 临床意义：为OCD修复提供无需预分化的“一体化”解决方案，简化手术流程并提高整合率。

亮点
- 单细胞来源类器官：避免多细胞共培养的复杂性。
- 天然微环境驱动：无需外源性生长因子梯度支架。
- 转化潜力：GelMA载体具有良好的生物相容性和可操作性。

其他价值
安全性评估显示类器官/GelMA复合物无全身毒性（肝肾功能指标正常），为后续临床试验奠定基础。