本文档属于类型a，即报告了一项原创研究。以下是对该研究的学术报告：
主要作者及研究机构
本研究由Beth K. Martin、Chengxiang Qiu、Eva Nichols、Melissa Phung、Rula Green-Gladden、Sanjay Srivatsan、Ronnie Blecher-Gonen、Brian J. Beliveau、Cole Trapnell、Junyue Cao和Jay Shendure等人共同完成。研究团队主要来自美国华盛顿大学基因组科学系（Department of Genome Sciences, University of Washington），部分作者还来自凯斯西储大学（Case Western Reserve University）、西雅图儿童医院（Seattle Children’s Hospital）、魏茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）和洛克菲勒大学（The Rockefeller University）等机构。研究于2023年1月发表在《Nature Protocols》期刊上。
学术背景
本研究属于单细胞转录组学领域，旨在优化单细胞组合索引RNA测序（sci-RNA-seq）技术。sci-RNA-seq是一种能够从指数级扩展的单个细胞或细胞核中恢复基因表达数据的强大方法。然而，原始的sci-RNA-seq协议复杂且在不同组织中的表现不稳定，灵敏度也较低。研究团队通过简化并优化了sci-RNA-seq的三级协议，开发出一种更快、更高产量、更稳健且更灵敏的版本，能够处理RNA酶（RNase）丰富的组织，如老年小鼠胚胎或成体组织。
研究流程
研究流程分为多个步骤，主要包括细胞核分离与固定、反转录、连接、第二链合成、蛋白酶消化、标签化（tagmentation）和PCR扩增等。以下是详细流程：
细胞核分离与固定：首先，研究团队从冷冻组织中分离细胞核，并使用二硫代双（琥珀酰亚胺丙酸酯）（DSP）和甲醇进行固定。DSP是一种胺交联剂，不会改变RNA，而甲醇则能够固定和渗透细胞核，使RNA更易获取。与原始协议中的多聚甲醛固定相比，DSP/甲醇固定显著提高了每个细胞的唯一分子标识符（UMI）数量。
反转录：固定后的细胞核被分配到96孔板中，使用带有条形码的oligo-dT引物进行反转录，引入第一个索引。反转录后，细胞核被汇集并重新分配到新的96孔板中。
连接：在第二个96孔板中，通过连接反应引入第二个索引。连接后，细胞核再次被汇集并分配到第三个96孔板中。
第二链合成：在第三个孔板中，进行第二链合成，形成双链DNA。随后，使用Tn5转座酶对双链DNA进行标签化，片段化并添加测序适配器。
蛋白酶消化：在标签化之前，使用蛋白酶消化细胞核，以提高Tn5转座酶的访问效率。这一步骤显著减少了实验的操作时间和成本。
PCR扩增：最后，通过PCR扩增引入第三个索引，并对文库进行纯化和测序。
主要结果
研究团队展示了优化后的sci-RNA-seq协议在E16.5小鼠胚胎中的应用，成功分析了约38万个细胞核。优化后的协议在RNA酶丰富的组织中表现出色，显著提高了每个细胞的UMI数量和基因检测数量。通过对比原始协议，优化后的协议在成本、操作时间和灵敏度方面均有显著提升。例如，每个细胞的试剂成本降低至1美分以下，总操作时间从细胞核分离到最终文库制备仅需2至3天。
结论与意义
本研究开发的优化sci-RNA-seq协议为单细胞转录组学研究提供了更高效、更经济的工具。该协议不仅能够处理RNA酶丰富的组织，还显著提高了实验的稳定性和灵敏度。此外，研究团队还引入了“tiny-sci”协议，适用于输入材料非常有限的实验，进一步扩展了sci-RNA-seq的应用范围。该研究为大规模单细胞转录组学研究提供了重要的技术支持，具有广泛的科学和应用价值。
研究亮点
1. 优化协议的高效性：优化后的sci-RNA-seq协议显著提高了实验的效率和灵敏度，能够处理RNA酶丰富的组织。 2. 低成本与高产量：每个细胞的试剂成本降低至1美分以下，且实验产量显著提高。 3. “tiny-sci”协议：适用于输入材料非常有限的实验，扩展了sci-RNA-seq的应用范围。 4. 广泛的应用前景：该协议为单细胞转录组学研究提供了强大的工具，具有广泛的应用潜力。
其他有价值的内容
研究团队还详细描述了实验中的关键试剂和设备的配置，如DSP、甲醇、Tn5转座酶等的使用方法，以及数据处理流程。这些细节为其他研究人员复现和优化实验提供了重要参考。此外，研究团队还公开了实验数据和代码，进一步促进了该技术的推广和应用。