本文作者为Moreno Wichert、Nikolaus Krall、Willy Decurtins、Raphael M. Franzini、Francesca Pretto、Petra Schneider、Dario Neri和Jörg Scheuermann。研究单位包括瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）化学与应用生物科学系、制药科学研究所，以及瑞士Otelfingen的Philochem AG公司。该研究于2015年1月26日在线发表于《Nature Chemistry》期刊，卷号第7卷，页码241–249，DOI为10.1038/nchem.2158。

研究背景

DNA编码化学文库（DNA-encoded chemical libraries, DECLs）是一类将小分子化合物与可扩增的DNA条形码偶联的分子集合，能够以极高通量的方式筛选与靶蛋白结合的化合物。传统的DECLs多采用单药效团展示（single-pharmacophore display）模式，即每个化合物仅展示一个药效团。而在双药效团展示（dual-pharmacophore display）模式下，两条互补DNA链的末端分别展示一个小分子片段，通过DNA杂交使两个片段在空间上接近，从而实现对靶蛋白的协同结合并利用螯合效应（chelate effect）。先前基于编码自组装化学（encoded self-assembling chemical, ESAC）文库的技术只能分别对两个子文库进行微阵列解码，无法确定哪个A片段与哪个B片段形成了富集的结合对，这极大限制了双药效团文库在从头发现配体方面的应用。本研究的核心目标是开发一种新的编码策略，使得文库中每一个双药效团成员都能在其DNA链上携带唯一的、可测序的编码信息，从而在高通量测序中精确鉴定协同结合的片段对，并将该方法用于从头发现配体和已知配体的亲和力成熟。

研究流程与实验设计

该研究首先构建了一个包含111,100个成员的双展示DNA编码化学文库，该文库由子文库A（550个药效团）和子文库B（202个药效团）通过DNA杂交组合而成。子文库A使用550条携带六碱基编码序列的5′氨基修饰48-mer寡核苷酸，分别与羧酸活化酯、磺酰氯或异硫氰酸酯反应，生成酰胺、磺酰胺或硫脲类偶联物，每个偶联物均经HPLC纯化并经LC-MS表征。子文库B则采用一条通用3′氨基修饰寡核苷酸，该寡核苷酸含有一段由六个脱碱基位点（d-spacer）组成的间隔区，可与子文库A的编码区进行宽松配对，同时阻止子文库B链在聚合酶链式反应（PCR）中被扩增。然后将202种化学片段与这条通用寡核苷酸偶联，再将产物与含有八碱基编码序列的39-mer寡核苷酸连接，连接过程中使用了一个嵌合DNA/RNA接头（adapter），之后通过RNase H或高pH处理去除该接头。

最终文库的组装方法为：将子文库A与子文库B杂交，形成组合双链文库；随后利用Klenow聚合酶催化的填充反应（fill-in reaction），将子文库B链上的编码信息复制到子文库A链上。该步骤的关键创新在于，子文库B中的脱碱基位点允许两条链在编码区形成非严格互补的配对，同时Klenow聚合酶可以跨越该区域进行延伸，从而使子文库A链同时携带A和B的药效团编码。通过这种编码转移策略，每个文库成员的身份信息都集中在同一条DNA链上，便于后续PCR扩增和高通量测序读取。

在文库验证和筛选阶段，研究者首先将该文库用于链霉亲和素（streptavidin）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）的亲和筛选。靶蛋白固定在链霉亲和素磁珠上，文库与靶蛋白孵育，洗去未结合成员，热变性洗脱结合物，PCR扩增子文库A链并引入筛选特异性条形码，然后使用Illumina HiSeq 2500进行高通量测序。测序数据由自行编写的C++程序解码，并用MATLAB软件进行可视化。

随后，该文库被用于α-1-酸性糖蛋白（alpha-1-acid glycoprotein, AGP）的从头配体发现。筛选后的测序数据显示药效团对A-117/B-113富集了1,300至3,500倍。为验证该结果，研究者将A-117和B-113分别偶联到带有荧光素标记的8-mer氨基修饰锁核酸（locked nucleic acid, LNA）上，组装成异源双链，通过荧光偏振（fluorescence polarization）测定结合亲和力。结果显示只有同时展示A-117/B-113的LNA双链能够结合AGP，解离常数（Kd）为190 ± 31 nM；单独展示A-117、B-113或无化合物的LNA双链均未显示可检测的结合。随后研究者合成了“脱DNA”（off-DNA）的A-117/B-113结合物1，使用赖氨酸-（PEG1）2连接子将两个片段连接。等温滴定量热（isothermal titration calorimetry, ITC）实验显示该异双价分子的解离常数为5.8 ± 2.3 μM，而单药效团对照化合物未能检测到结合。

在针对碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CAIX）的亲和力成熟实验中，乙酰唑胺（acetazolamide, AAZ）类似物B-202（琥珀酰-AAZ）与A-493形成的片段对在筛选中富集超过200倍。将A-493/B-202展示在LNA双链上后，荧光偏振测定显示其解离常数为14.6 ± 0.7 nM，而仅展示B-202的LNA解离常数为34.9 ± 0.9 nM。研究者进而合成了多个具有不同连接子长度和结构的“脱DNA”双价配体（4a–8b），其中含有Asp2连接子的化合物8b表现出最佳亲和力，荧光偏振法测得Kd为0.2 ± 0.1 nM；表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）测得化合物8a的Kd为2.6 nM。

在体内实验中，研究者将最佳配体8b中的荧光素替换为近红外染料IRDye 750，得到化合物8c。流式细胞术显示8c在CAIX阳性SK-RC-52肾癌细胞上的染色强度显著高于仅含乙酰唑胺部分的对照化合物4c，且8c不结合CAIX阴性的HEK细胞。随后研究者将8c、4c和非靶向对照9静脉注射到携带SK-RC-52皮下异种移植瘤的BALB/c nu/nu小鼠体内，进行近红外荧光成像和生物分布分析。结果表明，非靶向染料9在肿瘤部位没有优先富集；乙酰唑胺衍生物4c在早期可快速富集于肿瘤但随后逐渐解离；而高亲和力双价配体8c则表现出选择性和持久的肿瘤靶向。24小时定量生物分布分析显示，8c的肿瘤摄取为10 ± 2% ID/g，而4c仅为2.0 ± 0.3% ID/g。相比之下，作者此前开发的高亲和力人源单克隆抗体在相同肿瘤模型中的肿瘤摄取值为1–5% ID/g。

结论与意义

本研究成功构建了一个111,100成员的双药效团DNA编码化学文库，并通过链间编码转移策略实现了对每个片段对的明确解码。该技术解决了此前双药效团文库无法确定协同结合对的瓶颈问题。通过链霉亲和素、HRP、AGP和CAIX四个靶蛋白的筛选，研究者证明了该方法既能从头发现低微摩尔级的结合物，也能对已知低纳摩尔级配体进行亲和力成熟至亚纳摩尔级。在AGP筛选中，A-117/B-113片段对表现出了显著的螯合效应，因为单独片段均无法检测到结合；在CAIX筛选中，A-493/B-202双价配体8b的解离常数达到0.2 nM，且8c在体内实现了比单药效团配体和单克隆抗体优异的肿瘤靶向性能。

研究亮点

本研究的核心创新在于利用脱碱基位点和Klenow聚合酶介导的编码转移方法，使双展示文库中每个成员的身份信息整合于单一DNA链上，从而实现了高通量测序对协同结合片段对的直接解码。该方法具有通用性和可扩展性，原则上只需线性扩大两个子文库的规模，即可将文库大小指数级扩展至数十亿数量级。此外，该研究展示了双药效团文库在从头发现配体和亲和力成熟两个方面的应用潜力，为基于片段的药物发现提供了新的工具。研究还表明，通过优化连接子长度和结构，可以将DNA上筛选到的片段对转化为具有高亲和力的小分子双价配体，这些配体在肿瘤靶向应用中表现出优于抗体和单药效团配体的性能。

其他有价值内容

该研究还报告了AGP结合物1的ITC数据，显示该结合过程为焓驱动（ΔH = −47.3 ± 8.3 kJ mol−1），结合位点数n = 0.94 ± 0.16。此外，SPR和荧光偏振的互补结果提示，不同测量方法可能因表面固定化条件不同而产生不同的解离常数值。在生物分布分析中，研究者建立了器官特异性的荧光强度与% ID/g之间的线性回归曲线，为定量分析提供了标准化方法。这些数据和实验细节为后续研究提供了参考。