本研究的主要作者为 Oleg V. Kovalenko、Andrea Olland、Nicole Piché-Nicholas 等，所属机构包括 Pfizer 全球生物治疗技术部（美国剑桥）、Pfizer 苏格兰阿伯丁分部以及阿伯丁大学医学科学研究所。该论文发表于 *The Journal of Biological Chemistry*，2013 年 6 月 14 日，第 288 卷第 24 期，页码 17408–17419。

本研究的学术背景属于抗体工程与结构生物学交叉领域。鲨鱼体内存在一种称为免疫球蛋白新抗原受体（immunoglobulin new antigen receptor, IgNAR）的独特抗体类型，其抗原结合单元仅为单一可变结构域，称为 v-NAR。由于 v-NAR 分子量仅约 12 kDa，具有高稳定性、高溶解性和能识别传统抗体难以接触的抗原表位（如酶活性中心裂隙）等特性，因此被视为具有潜力的生物治疗候选分子。然而，将鲨鱼来源的 v-NAR 应用于人类治疗时，必须进行人源化改造以降低免疫原性。与骆驼源单域抗体（VHH）相比，鲨鱼 v-NAR 与人类抗体可变区序列同源性仅约 30%，且缺乏 CDR2 环，因此其人源化难度更大。本研究旨在对一种能特异性结合人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）的鲨鱼 v-NAR 克隆 E06 进行人源化，并通过解析其与抗原的复合物晶体结构，阐明抗原识别模式及人源化改造的结构基础。

研究流程分为多个阶段。第一阶段是获得针对 HSA 的鲨鱼 v-NAR。研究者用 HSA 免疫白斑角鲨（*Squalus acanthias*），从血清阳性个体中分离 v-NAR 序列并构建噬菌体展示文库，通过固相筛选获得克隆 E06。E06 属于 IV 型 v-NAR，仅含两个保守的半胱氨酸残基，CDR3 较短，且能结合人、小鼠和大鼠血清白蛋白。第二阶段是人源化设计。研究者首先尝试以人类 VH3 亚群框架 DP-47 对 I 型 v-NAR 5A7 进行人源化，但亲和力显著下降；随后改用人类 VL 亚群 Vκ1 的胚系框架 DPK9，因为该框架在结构上与 v-NAR 更相似且本身具有良好的稳定性和表达特性。对 5A7 的人源化通过“表面重塑”（resurfacing）策略替换框架区残基，获得了保留 HEL 结合活性的变体 5A7-IVabc，其 Kd 为 14.8 nM，与亲本 5A7 的 13.6 nM 相当。基于该策略，研究者对 E06 进行了一系列人源化改造，生成了 hue06 v1.1、v1.2、v1.3、v1.4、v1.5、v1.7 及 v1.10 等变体。其中 hue06 v1.1 保留了 N 端 4 个残基、CDR1、CDR3、HV2 及 HV4 等区域，将大部分框架区替换为 DPK9 序列，使非 CDR 区有 63.5% 的残基与人 DPK9 一致。第三阶段是功能筛选。研究者将亲本 E06 及各人源化变体表达为人 IgG1 Fc 融合蛋白，通过直接 ELISA 和夹心 ELISA 检测其与 HSA 的结合能力。结果显示 HV4 区的替换（K61S/T63S）对结合活性的损害比 HV2 区的替换更大，而 hue06 v1.5 完全丧失结合能力；hue06 v1.1 的结合活性相对保留最好，因此被选用于后续结晶研究。第四阶段是结构解析。研究者将 E06 和 hue06 v1.1 以 His6 标签单体形式在 HEK293-EBNA 细胞中表达，与 HSA 形成复合物后结晶。E06-HSA 复合物晶体属于 P3221 空间群，分辨率为 3.0 Å；hue06 v1.1-HSA 复合物晶体属于 P3121 空间群，分辨率为 2.3 Å。结构通过分子置换法解析，起始模型为 apo-HSA（PDB 编号 1AO6）。最终 Rwork/Rfree 分别为 23.7%/26.6%（E06）和 22.1%/25.9%（hue06 v1.1）。第五阶段是动力学分析。通过表面等离子体共振（Biacore T100）测定了 E06、hue06 v1.1 和 hue06 v1.10 在 pH 7.4 和 pH 6.0 下与 HSA、小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的结合动力学。第六阶段是 N 端突变体分析。研究者构建了一系列 E06 N 端突变体以验证 N 端残基对结合活性的影响，发现 N 端延伸一个氨基酸或替换 2–4 位残基均显著降低 HSA 结合能力。

主要结果如下。结构分析显示，E06 与 HSA 的结合模式与经典抗体识别方式不同。经典抗体主要依赖六个 CDR 参与抗原结合，而 E06 的 CDR1 几乎不参与结合，CDR3 与大量框架区残基共同构成结合界面。埋藏表面面积为 705 Ų，占 E06 总表面积的 12.5%。HSA 接触残基包括 Tyr32、Tyr35、Tyr37、Lys39、Ser44、Asn45、Lys46、Gln48、Arg84 以及 CDR3 的 Met86 至 Asp94 等 18 个残基。这种“侧向”结合模式首次在 v-NAR 中被发现，此前仅在骆驼 VHH 与胰淀粉酶复合物（PDB 1KXV/1KXT）中观察到类似现象。人源化变体 hue06 v1.1 的结构与 E06 高度相似，Cα 原子均方根偏差为 0.767 Å，除残基 38–40（E06 的 RKN 被替换为 DPK9 的 QQK）外，所有 HSA 接触残基均被保留。功能数据显示，hue06 v1.1 对 HSA 的结合在 pH 7.4 下降低约 85 倍，在 pH 6.0 下降低约 36 倍。为进一步恢复结合活性，研究者构建了 hue06 v1.10，恢复了 38RKN40 序列，其对 HSA 的亲和力降低幅度缩窄至 pH 7.4 下约 34 倍、pH 6.0 下约 13 倍。动力学数据显示，亲本 E06 对 HSA、小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的 Kd 分别为 0.19 nM、0.83 nM 和 1.45 nM（pH 7.4）。结构分析还揭示了物种特异性的结构基础：HSA 的 Ser232、Asp269 和 Ser270 是与 E06 高亲和力相关的关键残基；而牛血清白蛋白中的 Val229 和 Ala325 则可能导致空间位阻或疏水性降低，解释了 E06 不结合牛血清白蛋白的原因。此外，N 端残基 Thr1-Arg2-Val3-Asp4 之间形成氢键网络和疏水堆积，对维持 CDR3 的构象至关重要；HV2 区的 Arg38、Asn40 等残基通过氢键网络正确定向 Lys39、Ser44 和 Lys46 以结合 HSA；HV4 区的 Lys61 与 CDR1 的 Tyr32 主链形成氢键，Thr63 则通过影响 HV4 环的弯曲来定位 Lys61。这些结构上的解释说明了为何 HV2 或 HV4 区的人源化替换会导致结合活性下降。

本研究的结论是：鲨鱼 v-NAR E06 通过一种非典型的侧向结合模式识别 HSA，该模式利用框架区残基与 CDR3 共同形成抗原结合界面，而 CDR1 几乎不参与。该结合模式与此前已知的 v-NAR 结构（如 I 型 5A7 和 II 型 PBLA8）不同，提示 v-NAR 的抗原识别策略具有高度的结构可塑性。通过基于 DPK9 框架的表面重塑策略，研究者成功获得了人源化程度超过 60% 的变体 hue06 v1.1，其保留了亲本 E06 的大部分关键接触残基和空间构象。虽然亲和力有所下降，但通过恢复关键接触残基（hue06 v1.10）可以部分恢复结合活性。该研究建立了鲨鱼 v-NAR 人源化的结构框架，为后续设计更多人源化 v-NAR 并优化其亲和力提供了重要的结构信息和设计原则。

本研究的亮点包括：首次解析了 IV 型 v-NAR 与抗原的复合物结构；首次在 v-NAR 中发现侧向抗原结合模式，证明框架区残基可以在抗原识别中发挥主导作用；首次以人类 Vκ1 胚系框架 DPK9 为模板实现鲨鱼 v-NAR 的人源化，并验证了该策略的可行性；通过结构分析阐明了 HV2、HV4 及 N 端残基维持抗原结合和结构稳定性的分子机制；通过结构和动力学数据揭示了 E06 对不同物种血清白蛋白亲和力差异的结构基础。这些发现不仅加深了对鲨鱼 IgNAR 抗原识别机制的理解，也为基于 v-NAR 的下一代生物治疗药物开发提供了可操作的工程化策略。