一项关于 Aloysia polystachya 叶水醇提取物在斑马鱼（Danio rerio）模型中的抗焦虑与抗抑郁作用研究

主要作者与发表信息 本研究由 Nayara Costa de Melo、Brenda Lorena Sánchez-Ortiz、Tafnis Ingret dos Santos Sampaio、Arlindo César Matias Pereira 等多位研究人员共同完成，通讯作者为 José Carlos Tavares Carvalho。研究团队主要来自巴西的 Universidade Federal do Amapá（UNIFAP）药学研究实验室及相关研究生项目，部分合作者来自墨西哥 Universidad Nacional Autónoma de México 和 Universidad de la Sierra Sur，以及巴西 Universidade de Ribeirão Preto（UNAERP）。该研究成果于 2019 年 7 月 11 日发表于开放获取期刊 *Pharmaceuticals*，文献号为 Pharmaceuticals 2019, 12, 106。

学术背景与研究目的 精神与行为障碍已成为全球公共健康领域的主要挑战之一。据世界卫生组织（WHO）的统计数据，全球约3.6%的人口（约2.64亿人）患有焦虑障碍，4.4%的人口（约3.22亿人）受抑郁症困扰，且抑郁症预计将在2020年成为全球首位致残性疾病。临床上迫切需要开发新的替代治疗手段，而源自药用植物的生物活性分子一直是新药发现的重要源泉。南美洲本土植物 Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke（马鞭草科），俗名 “burrito”，在民间医学中常被用于消化和呼吸道疾病、作为镇静剂和抗抑郁剂以及神经滋补剂。已有研究表明，其叶提取物在小鼠和大鼠模型中表现出抗抑郁和镇静效果，其主要化学成分包括毛蕊花糖苷（acteoside）等苯乙醇苷类化合物。毛蕊花糖苷具有还原性和自由基清除能力，并能抑制单胺氧化酶 A（MAO-A）。斑马鱼（Danio rerio）因与哺乳动物存在高度的神经化学同源性，已成为一种有价值的毒理学和行为学分析动物模型，广泛用于焦虑、抑郁等情绪障碍研究。本研究旨在以斑马鱼为模型，系统评价 A. polystachya 叶的水醇提取物（HELAP）经口灌胃（gavage）和浸泡（immersion）两种给药途径的抗焦虑和抗抑郁作用。

详细研究流程 研究主要分为化学分析与行为药理学评价两大部分。

1. 提取物制备与化学分析
干燥的 A. polystachya 叶经水-乙醇（20:80, v/v）浸渍提取7天，过滤、减压浓缩并冻干，得到干燥粗提物（HELAP），得率约为7.1:1。
采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）对 HELAP 进行成分分析，色谱柱为 Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 柱，流动相为含0.1%甲酸的水和甲醇，梯度洗脱，负离子模式下采集质谱数据。通过对照品比对，证实主要色谱峰为毛蕊花糖苷。
利用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）对毛蕊花糖苷进行定量分析，建立标准曲线（r² = 0.9995），检测限（LOD）为 0.27 µg/mL，定量限（LOQ）为 0.89 µg/mL。测得 HELAP 中毛蕊花糖苷的含量为 99.74 ± 1.7 µg/mg 干提取物。

2. 行为学实验设计
实验对象为成年斑马鱼，通过两种给药途径分别进行抗焦虑和抗抑郁测试。 - 给药方式与剂量：浸泡给药浓度为 100 mg/L（含药物水体），口服灌胃剂量为 10 mg/kg。 - 抗焦虑实验——暗-光偏好测试（Scototaxis test）：采用经典的明暗穿梭箱测试。以咖啡因（100 mg/L 浸泡，或 100 mg/kg 口服）作为致焦虑剂，以丁螺环酮（buspirone，10 mg/L 浸泡或 100 mg/kg 口服）作为阳性对照。各组处理方法包括：空白对照组、咖啡因组、丁螺环酮+咖啡因组、HELAP+咖啡因组（每组 n=4）。观察参数包括：在白箱停留时间百分比、进入白箱的潜伏期（s）、明暗穿梭次数（alternations, n）、不规则游动次数（erratic swims, n）、僵滞时间（freezing, s）、趋壁行为时间（thigmotaxis, s）及风险评估次数（risk evaluation, n）。通过比较各组参数评估提取物对咖啡因所致焦虑行为的逆转作用。 - 抗抑郁实验——新缸潜水测试（Novel tank diving test, NTDT）：采用三种不同的抑郁诱导方式：1%乙醇暴露、不可预测慢性应激（光照、噪声等）以及社会隔离。阳性对照药物为氟西汀（fluoxetine，20 mg/kg）。各组设置为：抑郁模型对照组、模型+氟西汀组、模型+HELAP 组（每组 n=4）。评估参数包括：在鱼缸顶部停留的时间百分比、到达顶部的潜伏期、跨越象限数（quadrants crossed）、不规则游动次数、僵滞时长以及游动总距离。通过比较各组指标，判断 HELAP 的抗抑郁效果。

所有行为学实验均通过视频记录，并由经过培训的观察者进行盲法评分。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）继以 Tukey 事后检验，显著性水平设定为 p < 0.01。

主要研究结果

1. 化学成分鉴定结果
UPLC-MS 分析确认 HELAP 的主要活性成分为毛蕊花糖苷，其质量色谱图及负离子电喷雾质谱图均与标准品完全匹配。定量测定表明，毛蕊花糖苷在干燥提取物中含量很高，这为后续药理学评价提供了明确的物质基础。

2. 抗焦虑活性评价（暗-光测试）
- 白箱停留时间：丁螺环酮浸泡和口服组分别使斑马鱼在白箱的停留时间提升至 71.76% ± 5.51% 和 79.91% ± 5.26%；HELAP 浸泡和口服组同样显著增加至 57.27% ± 5.35% 和 65.39% ± 5.36%。而单独给予咖啡因的组别，白箱停留时间骤降至 11.83% ± 2.71%（浸泡）和 10.32% ± 2.77%（口服），与对照组有极显著差异（p < 0.01）。两种给药途径下，HELAP 均能显著逆转咖啡因引起的白箱回避行为。
- 穿梭次数：咖啡因组穿梭次数显著减少（浸泡 4.25 ± 0.96，口服 5.75 ± 0.58），而 HELAP 共处理组穿梭次数分别回升至 15.25 ± 0.5 和 17 ± 0.82，与丁螺环酮组（17 ± 0.81 和 18.5 ± 0.5）结果接近，表明提取物有效恢复了探索性行为。
- 进入白箱潜伏期：咖啡因显著延长了潜伏期至 344.33 ± 11.04 s（浸泡）和 318 ± 13.65 s（口服），而 HELAP 组则将潜伏期大幅缩短至 157 ± 9.64 s（浸泡）和 141.15 ± 14.33 s（口服），效果与丁螺环酮相当。
- 僵滞时间：咖啡因组僵滞时间高达 60.73 ± 4.21 s（浸泡）和 66.83 ± 3.21 s（口服），HELAP 组则降至与对照组无差异的水平（浸泡 25.40 ± 4.17 s，口服 23.85 ± 2.03 s），表明药物降低了焦虑相关的防御性不动状态。
- 不规则游动：咖啡因组该项指标升高至 11 ± 1.15 和 12 ± 0.82 次，而 HELAP 组低至 4 ± 0.82 和 3.25 ± 0.96 次，提示提取物有效抑制了焦虑引起的随机逃避行为。
- 趋壁行为：咖啡因使趋壁时间显著延长（132.45 ± 1.15 s 和 130.03 ± 1.35 s），HELAP 处理组趋壁时间约 52 s，显著低于咖啡因组，再次证实焦虑程度的降低。
- 风险评估：咖啡因组风险评估次数分别为 18 ± 0.82 和 20 ± 0.82，HELAP 组降至 8.50 ± 0.58 和 5.50 ± 0.58，说明提取物减少了斑马鱼在明暗交界处的反复试探行为。
上述所有参数变化均具有统计学意义（p < 0.01），且 HELAP 在两种给药途径下均未表现出明显的运动抑制，证明其抗焦虑作用并非源于非特异性镇静效应。

3. 抗抑郁活性评价（新缸潜水测试）
- 缸顶停留时间：1%乙醇、慢性应激和社会隔离单独处理组在缸顶的时间百分比均降至 13%–23% 范围。联合给予氟西汀后，各模型组缸顶停留时间升至约 80%–87%；HELAP 处理组升至 67%–79%，虽然绝对数值略低于氟西汀，但仍显著高于各模型对照组（p < 0.01），提示提取物具有明确的抗抑郁作用。
- 到达缸顶潜伏期：三种抑郁模型组的潜伏期均显著延长，而氟西汀使潜伏期降至 8.43–19.95 s，HELAP 处理后潜伏期亦降至 12.68–26.48 s，表明药物能帮助动物克服对新环境的回避。
- 跨越象限数：抑郁模型组游动活跃度降低，跨越象限数减少。HELAP 与氟西汀均使该参数成倍增加，如乙醇模型口服组从 18.25次升至 123.75次（HELAP），展现出对抑郁所致运动减少的显著改善。
- 不规则游动与僵滞时间：所有抑郁模型组均表现不规则游动增多和僵滞时间延长。氟西汀和 HELAP 能显著降低这两项指标，例如乙醇模型口服组僵滞时间从 35.75 s 降至 7.0 s（HELAP）。
- 游动距离：抑郁模型组总游动距离显著缩短，而HELAP共处理组距离增加，证实提取物改善了抑郁样行为所伴发的低活动水平。
总体而言，三种不同抑郁诱导手段所致的缸底偏爱、运动减少和高僵滞状态均被 HELAP 有效逆转，且口服给药效果通常略优于或等同于浸泡给药，两种途径的作用趋势高度一致。

结论与研究价值 本研究首次在斑马鱼模型中系统证实了 Aloysia polystachya 水醇提取物（HELAP）经由口服灌胃和浸泡方式均能产生显著的抗焦虑和抗抑郁样效应。在暗-光测试中，HELAP 在不损害运动能力的情况下逆转了咖啡因诱发的所有焦虑行为学指标；在新缸潜水测试中，HELAP 对乙醇暴露、慢性应激和社会隔离三种模型造成的抑郁样行为均有与氟西汀类似的改善效果。化学分析表明主要成分为毛蕊花糖苷，文献已报道该化合物具有单胺氧化酶A（MAO-A）抑制作用，这可能是其抗焦虑和抗抑郁活性的药理学基础。
该研究的科学价值在于，利用斑马鱼这一高通量脊椎动物模型，通过两种给药途径的对比，提供了更为全面的药效证据；同时，口服给药在鱼类模型上的成功应用提升了该模型的转化医学价值。应用价值方面，该研究为基于 A. polystachya 开发新型治疗情绪障碍的植物药或先导化合物提供了重要的药理学依据。

研究亮点 1. 首次在斑马鱼上验证该植物的精神药理学作用：过去的研究局限于啮齿类动物，本工作拓展至斑马鱼模型，并涵盖了八项抗焦虑参数和六项抗抑郁参数，多维度确认了药效。 2. 给药途径的全面比较：同时采用药物浸泡和口服灌胃两种方法，且结果高度一致，证明了提取物的有效成分可通过鱼类的肠道和鳃两种途径良好吸收，且口服给药效果更明显，增强了结果的可信度和对人用前景的暗示。 3. 多重抑郁模型的应用：采用1%乙醇、慢性应激和社会隔离三种方式造模，弥补了单一模型可能存在的局限性，使得抗抑郁结论更为稳健。 4. 明确的主成分指向：通过 UPLC-MS 和 HPLC-DAD 确认并定量了主要化合物毛蕊花糖苷，将行为学药效与特定分子实体相关联，为后续机制研究和质量控制奠定了基础。

其它有价值内容 研究在讨论部分深入分析了各行为参数的含义，例如僵滞代表对厌恶情境的完全不动防御，趋壁行为反映了寻求逃离的动机，风险评估则体现冲突性探索。这些参数的综合变化构成了评价情绪障碍行为的完整图景。此外，作者还提及毛蕊花糖苷此前被 Carvalho 等人在大鼠研究中报道可能具有中枢抑制作用，而本研究结果则表明其或在整体提取物中与其他成分产生协同效应，最终表现为有益的精神调解作用。这一细节提示了后续对纯化合物与提取物整体进行直接对比研究的必要性。该文章为天然产物神经药理学领域增添了重要数据，也为传统医学中“burrito”的应用提供了现代化解释。