本研究由郑州大学第一附属医院血液科的曹伟杰、范文娟、王芳等作为共同第一作者，郑州大学第一附属医院的蒋忠兴（Zhongxing Jiang）教授、杜春燕（Chunyan Du）教授以及李伟（Wei Li）副教授作为共同通讯作者牵头完成。该研究论文发表于Journal of Translational Medicine期刊，于2022年正式刊出（卷20，第11期）。这是一篇报道单一原创性研究的学术论文。

一、 学术背景与研究目的

本研究立足于血液学和免疫学的交叉领域，聚焦于炎症相关贫血（Anemia of Inflammation, AI）的发病机制探索。炎症是许多慢性疾病（如类风湿关节炎、COVID-19）和血液系统恶性肿瘤的常见伴随状态，常导致贫血。这种炎症性贫血（AI）的确切机制尚未完全阐明。巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF）是一种重要的髓系造血生长因子和促炎细胞因子，在健康人外周血中几乎检测不到，但在多种炎症性疾病（包括COVID-19）中表达显著上调，并已成为潜在的治疗靶点。尽管有研究提示GM-CSF可能与镰状细胞病中的血红蛋白表达调控有关，并存在于炎症性贫血小鼠模型中，但GM-CSF本身在成人和小鼠红细胞生成（Erythropoiesis）中的具体角色尚不明确。

红细胞生成是一个复杂的过程，依赖于一种特殊的骨髓微环境结构——幼红细胞岛（Erythroblastic Island, EBI）。EBI由位于中心的巨噬细胞（称为EBI巨噬细胞）及其周围环绕的多个不同发育阶段的幼红细胞构成。EBI巨噬细胞通过物理粘附、分泌生长因子、提供铁质、吞噬衰老红细胞和清除脱核后的细胞核等多种方式，对红细胞的成熟发挥至关重要的支持和调控作用。研究表明，其他造血生长因子如促红细胞生成素（EPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）可以通过影响EBI巨噬细胞的功能来调控红细胞生成。然而，与G-CSF的作用被广泛研究不同，GM-CSF在这一过程中的“精准”角色尚属未知。

因此，本研究旨在系统探究GM-CSF对红细胞生成的影响，并深入剖析其作用是否以及如何通过干扰EBI巨噬细胞的功能和EBI的稳定性来实现。研究最终目标是为理解炎症性贫血的病理机制提供新视角，并为靶向GM-CSF或EBI巨噬细胞的新型治疗策略提供理论依据。

二、 详细研究流程

本研究采用了从体外到体内、从人到小鼠的多层次、系统性研究策略，流程严谨而全面。

第一部分：体外研究——GM-CSF对人EBI形成的影响及机制初探

1. 研究对象与模型构建：研究者利用健康捐赠者脐带血来源的CD34+造血干细胞，通过特定的细胞因子组合进行体外定向分化。首先，分化为晚期幼红细胞（培养第11天）和“类EBI”巨噬细胞。这是一种成熟、可靠的体外模拟人EBI形成的模型。
2. 实验处理：将分化好的“类EBI”巨噬细胞分为两组：对照组（仅用EPO处理）和实验组（用GM-CSF + EPO处理24小时）。
3. EBI形成实验：将处理后的巨噬细胞与晚期幼红细胞按1：20的比例共培养12小时。通过细胞离心涂片（cytospin）和吉姆萨-瑞氏染色，在显微镜下观察并定量分析EBI的形成情况。EBI定义为至少有一个巨噬细胞被三个或更多幼红细胞环绕的结构。研究统计了与不同数量幼红细胞（0，1-2，3-4，≥5）相关的EBI百分比。
4. 受体表达分析：通过分析团队已有的RNA测序（RNA-seq）数据库和实时定量PCR（qRT-PCR），检测了G-CSFR、GM-CSFR和M-CSFR在EBI巨噬细胞及各阶段幼红细胞中的mRNA表达模式，以确定GM-CSF作用的直接靶细胞。
5. 粘附分子表达检测：通过qRT-PCR检测了GM-CSF处理对巨噬细胞表面关键粘附分子（CD163， CD169， EMP， αV-整合素）mRNA表达的影响，这些分子介导巨噬细胞与幼红细胞之间的粘附。
6. 转录组学分析（RNA-seq）：对对照组和GM-CSF处理组的“类EBI”巨噬细胞进行RNA-seq，以全面揭示GM-CSF引起的转录组变化。数据分析包括：主成分分析（PCA）、差异表达基因筛选（使用DESeq2软件）、基因集富集分析（GSEA）以及关注与EBI巨噬细胞功能（粘附、吞噬、铁回收、免疫调节）相关基因的表达变化。还分析了关键转录因子的变化。

第二部分：体内研究——GM-CSF对小鼠红细胞生成及EBI的影响

1. 动物模型：使用8-12周龄的野生型C57BL/6小鼠。实验组小鼠通过腹腔注射GM-CSF（300 μg/kg），注射方案有单次（D0-D1）或多次（D0-D3），对照组注射溶剂。
2. 表型分析：
   • 外周血分析：通过眼眶取血，使用血液分析仪检测红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容和网织红细胞计数，评估GM-CSF是否引起外周血贫血。
   • 骨髓（BM）红细胞生成分析：
     • 红系祖细胞：通过流式细胞术，使用特定的表面标志物组合（Lin−CD16−CD32−CD41−CD34−Sca1−CD117+CD71）对爆发式红系集落形成单位（BFU-E）和红系集落形成单位（CFU-E）进行识别和绝对计数。
     • 终末分化幼红细胞：使用Ter119（红系标志物）结合CD44和细胞大小（FSC），通过流式细胞术将骨髓中的幼红细胞精确分为早幼、嗜碱性、多染性和正染性四个阶段，并进行绝对计数。
   • 脾脏分析：称量脾脏并计算脾脏指数（脾重/体重），通过流式细胞术分析脾脏内幼红细胞比例，并通过冰冻切片苏木精-伊红（HE）染色观察组织形态，评估GM-CSF是否诱导应激性红细胞生成（髓外造血）。
3. EBI分析：
   • EBI富集与计数：采用密度梯度离心法特异性富集小鼠骨髓中的EBI。这是一种经典但技术要求较高的方法，能够相对完整地分离出EBI结构。富集后通过细胞离心涂片，在显微镜下直接计数每个玻片上的EBI数量，并统计每个EBI巨噬细胞周围环绕的幼红细胞平均数。
   • EBI巨噬细胞分析：
     • 数量与表型：通过流式细胞术（标志物：CD11b, Gr-1, F4/80）鉴定和计数骨髓中的EBI巨噬细胞（CD11b−Gr-1−F4/80+），并检测其F4/80的表达强度。
     • 信号通路：通过流式细胞术检测细胞内磷酸化STAT5（p-STAT5）水平，验证GM-CSF是否通过其受体激活了巨噬细胞内的JAK2-STAT5信号通路。
     • 粘附分子表达：通过流式细胞术检测EBI巨噬细胞表面关键粘附分子CD163、CD169和VCAM-1的蛋白表达水平。
     • 吞噬功能相关分子：通过流式细胞术检测与吞噬凋亡细胞相关的分子Mertk、Axl和Timd4的表面表达。
     • 吞噬功能检测：采用细胞内染色法，通过流式细胞术检测骨髓EBI巨噬细胞内Ter119阳性信号（即被吞噬的红细胞），定量分析其吞噬衰老红细胞的能力。
     • 极化表型：
       • 表面标志物：通过流式细胞术检测M1型（MHC-II， CD14， CD80）和M2型（CD206， CD86， CD163）相关标志物的表达。
       • 细胞因子mRNA：通过qRT-PCR检测从骨髓中分选出的F4/80+巨噬细胞中M1相关因子（iNOS， IL-1β， TNF-α）和M2相关因子（Arg1， IL-10， TGF-β）的mRNA表达。
4. 巨噬细胞清除实验（辅助验证）：为验证巨噬细胞减少本身是否足以导致幼红细胞减少，研究者使用了氯膦酸盐脂质体（clodronate-loaded liposomes）腹腔注射，特异性清除小鼠体内的巨噬细胞，然后分析骨髓幼红细胞数量的变化。

三、 主要研究结果

第一部分：体外结果 1. GM-CSF损害人EBI形成：与对照组相比，经GM-CSF预处理的巨噬细胞形成的EBI中，环绕3个、4个或5个以上幼红细胞的EBI比例显著下降，而仅有0个或1-2个幼红细胞的EBI比例显著上升，表明GM-CSF严重破坏了巨噬细胞支持EBI形成的能力。 2. GM-CSF通过巨噬细胞间接发挥作用：RNA-seq和qRT-PCR数据显示，GM-CSF受体在EBI巨噬细胞中高表达，但在晚期幼红细胞中表达极低或检测不到，提示GM-CSF主要通过作用于巨噬细胞来影响红细胞生成。 3. 粘附分子CD163是关键靶点：qRT-PCR显示，GM-CSF处理显著降低了巨噬细胞粘附分子CD163的mRNA表达，而对CD169、EMP和αV-整合素的影响不显著。这初步揭示了GM-CSF破坏细胞间粘附的分子机制。 4. 转录组学揭示多重功能损害：RNA-seq分析证实了GM-CSF处理引起巨噬细胞基因表达的全局性改变。GSEA分析显示，上调的通路与免疫调节（如移植物抗宿主病、抗原提呈）相关，而下调的通路则与EBI巨噬细胞的支持功能密切相关，包括吞噬体形成、VEGF信号通路和细胞外基质受体相互作用。具体基因分析显示，除CD163外，与吞噬功能相关的Mertk、Marco，以及与铁回收相关的HMOX1表达均下降。同时，抗原提呈相关分子（HLA-DR等）和促炎趋化因子（CCL1， CCL8， CCL13）表达上调。关键的支持性转录因子Maf和Nr1h3的表达也显著下降。

第二部分：体内结果 1. GM-CSF抑制小鼠骨髓红细胞生成但不引起外周血贫血或脾脏应激造血： * GM-CSF处理显著减少了骨髓中处于终末分化各阶段的幼红细胞的绝对数量，但未影响更早期的BFU-E和CFU-E祖细胞数量。 * GM-CSF处理未导致小鼠外周血红细胞参数（红细胞数、血红蛋白等）发生显著变化，即未引起明显的贫血。这可能与实验周期较短或GM-CSF单因素作用强度不足有关。 * GM-CSF处理未增加脾脏指数、脾脏内幼红细胞比例或引起脾脏组织结构改变，说明其不诱导应激性红细胞生成（髓外造血），这与G-CSF的作用不同。 2. GM-CSF破坏小鼠骨髓EBI稳定性： * EBI富集实验直接证明，GM-CSF处理显著降低了骨髓中EBI的数量，并且每个残存EBI中巨噬细胞周围的幼红细胞数量也减少。 * 机制探究发现：① GM-CSF处理减少了骨髓中EBI巨噬细胞（F4/80+）的绝对数量，并降低了其F4/80的表达强度。② GM-CSF激活了巨噬细胞内的STAT5磷酸化。③ 流式细胞术检测显示，EBI巨噬细胞表面的粘附分子CD163和VCAM-1的蛋白表达水平显著下降，而CD169无变化。这与体外CD163的结果一致，并补充了VCAM-1这一关键分子。 * 巨噬细胞清除实验验证：使用氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞后，同样观察到骨髓幼红细胞数量的显著下降，这支持了“GM-CSF通过减少EBI巨噬细胞数量进而导致幼红细胞减少”的推论。 3. GM-CSF损害EBI巨噬细胞的吞噬功能并诱导其向M1型极化： * 吞噬功能受损：GM-CSF处理显著降低了EBI巨噬细胞表面吞噬相关受体Mertk、Axl和Timd4的表达。功能实验进一步证实，GM-CSF处理组巨噬细胞内吞噬的Ter119阳性红细胞比例显著低于对照组，表明其清除衰老红细胞的能力下降。 * 表型极化：GM-CSF处理使EBI巨噬细胞向促炎的M1型转化。具体表现为：表面标志物MHC-II表达升高，CD206（M2标志）表达降低；mRNA水平上，M1相关因子（iNOS， IL-1β， TNF-α）表达上调，而M2相关因子（Arg1， IL-10， TGF-β）表达下调。

四、 研究结论与意义

本研究系统而有力地证明：GM-CSF作为一种关键的促炎因子，能够通过多重机制损害EBI巨噬细胞的功能，从而破坏幼红细胞岛的稳定性，最终抑制红细胞生成。 具体结论如下：

1. GM-CSF通过下调EBI巨噬细胞表面的粘附分子（如CD163和VCAM-1），削弱了巨噬细胞与幼红细胞之间的物理连接，导致EBI结构解体。
2. GM-CSF减少骨髓中EBI巨噬细胞的数量，进一步削弱了支持红细胞生成的微环境。
3. GM-CSF下调EBI巨噬细胞表达吞噬相关受体（Mertk， Axl， Timd4），损害其清除衰老红细胞和脱核细胞核的能力。
4. GM-CSF诱导EBI巨噬细胞从具有支持功能的M2样表型向促炎状态的M1样表型极化，使其功能从“支持造血”转向“免疫调节”。

科学价值：该研究首次详细阐明了GM-CSF在成人及小鼠红细胞生成中的具体作用及其细胞与分子机制，填补了该领域的知识空白。它将炎症因子（GM-CSF）、骨髓微环境（EBI）和疾病（炎症性贫血）三者紧密联系起来，为理解炎症性贫血的复杂病理机制提供了全新的、重要的视角。

应用价值：研究提示，靶向GM-CSF或其信号通路，或者通过药物重编程将M1型EBI巨噬细胞逆转为M2型，可能成为治疗炎症相关贫血的新型策略。鉴于GM-CSF本身已是多种炎症性疾病（如类风湿关节炎、COVID-19相关细胞因子风暴）的治疗靶点，本研究的发现为在这些疾病中观察到的贫血并发症提供了潜在的解释和联合治疗思路。

五、 研究亮点

1. 机制创新性：率先系统揭示了GM-CSF通过破坏EBI巨噬细胞功能来抑制红细胞生成的完整通路，从粘附、数量、吞噬到极化表型，机制阐述全面而深入。
2. 研究策略系统性：采用了从体外（人源细胞模型）到体内（小鼠模型），从表型到机制（流式、RNA-seq、功能实验），从细胞到分子的多层次研究策略，证据链完整，说服力强。
3. 模型可靠性：成功应用了人脐带血CD34+细胞分化的“类EBI”体外共培养模型，以及小鼠骨髓EBI密度梯度富集技术，这些是研究EBI功能的经典且有效的方法。
4. 发现的特异性与对比性：研究明确了GM-CSF与G-CSF在影响红细胞生成上的不同（G-CSF可诱导脾脏造血，而GM-CSF不能），突出了GM-CSF作用的独特性。
5. 临床关联性强：研究问题直接源于临床现象（炎症性贫血），结论与多种炎症性疾病的病理生理和潜在治疗紧密相关，具有明确的转化医学价值。