天津理工大学硕士学位论文《有机磷酸酯及全（多）氟烷基化合物对肝细胞的毒性作用与机制研究》学术报告

作者与机构
该研究由天津理工大学环境科学与工程学院孙轩在岳俊杰副教授和张连营副教授指导下完成，2023年6月作为硕士学位论文提交。研究数据通过万方数据平台收录。

学术背景
研究聚焦环境毒理学领域，针对两类典型环境污染物——有机磷酸酯（Organophosphate Esters, OPFRs）和全（多）氟烷基化合物（Per- and Poly-Fluoroalkyl Substances, PFASs）的肝毒性机制展开。背景知识显示：
1. OPFRs：以磷酸三苯酯（Triphenyl Phosphate, TPHP）为代表，广泛用于阻燃剂和增塑剂，其代谢产物磷酸二苯酯（Diphenyl Phosphate, DPHP）在人体内持续积累。流行病学证据表明TPHP暴露与2型糖尿病风险相关，但TPHP与DPHP的毒性差异机制不明。
2. PFASs：全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane Sulfonic Acid, PFOS）因持久性被限制使用后，其替代品全氟壬烯氧基苯磺酸钠（OBS）的毒性缺乏系统评估。肝脏作为两类污染物的主要靶器官，其毒性通路尚未明确。

研究目标包括：
- 比较TPHP与DPHP对肝细胞胰岛素抵抗的诱导机制
- 验证TPHP在活体模型中干扰糖代谢的效应
- 揭示PFOS与OBS的差异毒性通路

研究流程与方法
1. 细胞模型构建
- 使用人正常肝细胞（L02），通过CCK-8法测定TPHP/DPHP/PFOS/OBS的24小时半数抑制浓度（IC50），确定后续实验剂量（TPHP/DPHP: 50 μM；PFOS/OBS: 100 μM）。
- 转录组测序（RNA-Seq）采用BGISEQ-500平台，差异基因筛选标准为|log2FC|≥1且p<0.05，通过KEGG和GO富集分析关键通路。

1. 葡萄糖代谢机制研究

   • 体外实验：采用荧光标记的2-脱氧葡萄糖检测胰岛素刺激下的葡萄糖摄取，肝糖原含量通过酶解法测定。内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）标志基因（CHOP、XBP1、ATF4）表达通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证，并使用特异性抑制剂4-PBA（1 mM）进行通路阻断实验。
     
   • 体内验证：C57BL/6J雄性小鼠分为对照组、TPHP暴露组（80 mg/kg）、TPHP+4-PBA联合组，通过胰岛素耐量试验（ITT）和肝糖原含量测定评估糖代谢紊乱。
     

2. PFASs毒性比较研究

   • 通过RNA-Seq识别PFOS与OBS的差异通路后，采用流式细胞术检测凋亡率，ELISA法测定炎症因子（IL-6、TNF-α、IL-1β），铁死亡通过细胞内铁离子含量和脂质过氧化标志物评估，胆固醇合成关键基因（HMGCR、SQLE）表达通过RT-qPCR分析。
     

主要结果
1. TPHP与DPHP的毒性差异
- RNA-Seq显示TPHP显著激活ERS通路（p=0.003），而DPHP无此效应。TPHP暴露使L02细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取降低42%（p<0.01），糖原合成减少58%（p<0.001），且ERS标志基因CHOP表达上调3.2倍（p<0.01）。4-PBA预处理可逆转TPHP诱导的糖代谢异常（恢复率＞80%）。
- 小鼠实验中，TPHP组餐后血糖升高31%（p<0.05），肝糖原下降45%（p<0.01），且肝脏ERS基因表达与体外结果一致。

1. PFOS与OBS的机制分异
   
   • PFOS主要干扰类固醇合成通路（富集比=4.7，p=0.01），导致胆固醇（TC）水平下降37%（p<0.05）；OBS则激活ECM-受体相互作用通路（富集比=5.2，p=0.008），使细胞外基质基因CD44表达上调4.8倍（p<0.001）。
     
   • OBS的凋亡率（22.4%）显著高于PFOS（13.1%，p<0.05），且促炎因子IL-6分泌量增加2.3倍（p<0.01），表明其毒性更强。
     

结论与价值
1. 科学价值
- 首次阐明TPHP通过ERS通路诱发胰岛素抵抗的分子机制，而DPHP因结构差异缺乏此效应，为OPFRs代谢产物的风险评估提供新依据。
- 证实OBS并非理想PFOS替代品，其通过ECM通路和铁死亡加剧肝损伤，提示需重新评估其环境准入标准。

1. 应用意义
   
   • 为糖尿病环境致病因素研究提供新靶点（ERS-CHOP通路）。
     
   • 提出4-PBA作为潜在解毒剂的干预策略，具有转化医学潜力。
     

研究亮点
1. 方法创新：整合转录组学与经典毒理学，从基因网络层面解析毒性通路。
2. 发现新颖性：揭示OBS的ECM干扰机制为首次报道，填补PFASs替代品毒性认知空白。
3. 跨尺度验证：从细胞（L02）到动物（C57BL/6J）的多层次证据链增强结论可靠性。

其他价值
研究建立的肝细胞毒性筛查平台可扩展应用于其他新兴污染物的风险评估，论文中提供的RNA-Seq数据（登录号：GSEXXXXXX）为后续研究提供重要资源。