2018年1月3日，国际顶级医学期刊《The New England Journal of Medicine》（NEJM）在线发表了一篇题为“Somatic Activating KRAS Mutations in Arteriovenous Malformations of the Brain”的原创性研究论文。这篇研究由Sergey I. Nikolaev博士、Sandra Vetiska博士、Juhana Frösen博士、Jason E. Fish博士和Ivan Radovanovic博士共同领导，来自瑞士日内瓦大学、加拿大多伦多大学医疗网络、芬兰库奥皮奥大学医院等多个国际顶尖机构的研究团队共同完成。这项研究首次揭示了散发性脑动静脉畸形（Arteriovenous Malformations of the Brain， bAVMs）发生的关键遗传学病因，即体细胞激活型KRAS基因突变。
学术背景与研究目的 脑动静脉畸形是一种高流速的血管畸形，在脑动脉和静脉之间形成了异常的、迂曲的血管通道，缺乏正常的毛细血管网。这使得高压力的动脉血直接“短路”进入静脉流出系统，是导致儿童和青壮年出血性中风的首要原因之一。尽管其临床表现严重，但绝大多数散发性脑动静脉畸形的根本原因一直未知。虽然在一些罕见的遗传综合征（如遗传性出血性毛细血管扩张症、毛细血管畸形-动静脉畸形综合征）中发现了类似病变与特定基因相关，但这些仅能解释极少数病例。绝大多数的脑动静脉畸形是散发性的，无家族史。因此，研究团队假设，这些局灶性的血管畸形可能源于颅脑血管系统中的体细胞突变，即在个体发育过程中，血管特定细胞自发产生的基因突变，而非从父母遗传而来。本研究的目的正是为了系统地探索散发性脑动静脉畸形组织中是否存在体细胞突变，并鉴定出关键的致病基因，进而阐明其分子机制。
详细研究流程 本研究是一项严谨的多阶段、多中心研究，整合了基因组学、分子生物学和细胞功能学等多种技术手段。
第一阶段是突变筛查与验证。研究招募了两个独立的患者队列：主要研究组（加拿大，39名患者）和独立验证组（芬兰，33名患者）。所有患者均符合严格标准，包括确诊为散发性、单发的脑动静脉畸形，并有数字减影血管造影证据，无家族史或其他遗传性血管疾病。研究人员从手术切除的脑动静脉畸形病灶（nidus）组织以及部分患者的引流静脉（draining vein）中获取样本，同时收集了匹配的血液样本作为正常对照。对于主要研究组，研究流程首先对26例组织的DNA进行了全外显子组测序（Whole-exome sequencing），并对其中17例的配对血液样本进行了测序。这一高通量测序旨在无偏倚地扫描所有编码基因区域的体细胞突变。初步分析在4例样本中发现了KRAS基因的热点激活突变（Gly12Asp或Gly12Val）。随后，他们采用灵敏度更高的微滴数字PCR技术（Droplet digital PCR, ddPCR）对39例主要研究组样本（包括经测序的26例和新增的13例）进行了KRAS特定突变的定量检测，并将结果与测序发现进行了交叉验证。此外，他们还设立了对照组织，包括正常脑皮质血管、海绵状血管畸形、硬脑膜动静脉瘘以及胶质增生组织，以确保检测的特异性。在独立验证组中，研究人员则利用从33例福尔马林固定、石蜡包埋的脑动静脉畸形组织样本中提取的DNA，专门采用ddPCR技术检测了相同的KRAS突变。为了防止因DNA损伤造成的假阳性（尤其在石蜡包埋组织中），他们使用了尿嘧啶DNA糖基化酶处理样本以去除脱氨基损伤。
第二阶段是突变细胞的定位研究。为了确定KRAS突变存在于哪种细胞类型中，研究团队从6例新鲜的脑动静脉畸形组织中分离并建立了原代细胞培养物。他们使用抗CD31的磁珠通过磁激活细胞分选技术，将细胞分为内皮细胞富集（CD31+）部分和内皮细胞去除（CD31-）部分。CD31是血管内皮细胞的特异性标志物。随后，他们对这些分选后的细胞以及未经分选的整体组织样本，分别进行ddPCR分析，以比较KRAS突变等位基因频率的变化。
第三阶段是机制探索与功能验证。这是研究的核心机制部分，旨在阐明KRAS突变如何导致疾病。首先，他们在体外培养的人脐静脉内皮细胞中表达了激活型KRAS突变体（KRASG12V），并通过蛋白质印迹法检测了KRAS下游关键信号通路（如MAPK-ERK通路、PI3K-AKT通路）的激活状态。同时，他们也检测了从脑动静脉畸形患者分离的内皮细胞富集培养物中这些通路的磷酸化水平。其次，他们对表达KRASG12V的内皮细胞进行了RNA测序，分析其基因表达谱的全局性变化，特别关注与血管生成、内皮细胞迁移、细胞连接和Notch信号通路相关的基因。最后，他们通过活细胞成像等技术，在体外观察了表达突变KRAS的内皮细胞在形态、细胞骨架（肌动蛋白）动态、迁移能力和细胞间连接（血管内皮钙粘蛋白）等方面的表型变化。为了验证观察到的表型是否由特定的信号通路介导，他们还使用了MAPK-ERK通路的小分子抑制剂进行干预，观察这些表型能否被逆转。
主要研究结果 本研究取得了系列明确的、相互印证的成果，逐步揭示了脑动静脉畸形的致病机制。
KRAS突变在脑动静脉畸形组织中高频存在：全外显子组测序初步发现了KRAS的激活突变。随后，ddPCR分析确认，在主要研究组的39例样本中，有29例（74%）检测到了KRAS突变。突变类型主要是c.35G→A和c.35G→T，均导致第12位甘氨酸被替换。在独立验证组的33例样本中，有16例（48%）检测到了相同的突变。而所有配对的血液样本以及作为对照的其他类型血管病变（海绵状血管瘤等）或正常血管组织中，均未检测到这些突变。这强有力地证明了这些KRAS突变是特异存在于脑动静脉畸形组织中的体细胞突变。值得注意的是，突变等位基因频率（即携带突变的DNA分子比例）普遍较低（0.5%至4%），提示突变仅存在于病灶内一小部分细胞中。
KRAS突变特异性存在于血管内皮细胞中：细胞分选实验是本研究的关键发现之一。ddPCR结果显示，从患者组织中分选出的CD31+内皮细胞富集部分，其KRAS突变等位基因频率相较于未分选的整体组织有显著提高（富集倍数达2.8至61.8倍），最高可达52.15%。这意味着在这些培养物中，相当大比例甚至可能是大部分的内皮细胞携带了KRAS突变。相反，来自同一患者组织的CD31-细胞部分（主要为平滑肌细胞等）则完全检测不到突变。这一发现将致病基因突变精确定位到了血管内皮细胞，明确了内皮细胞是驱动病变的细胞来源。
KRAS突变激活MAPK-ERK信号通路：功能研究显示，无论是在表达KRASG12V的体外内皮细胞中，还是在从患者分离的、携带KRAS突变的内皮细胞富集培养物中，细胞外信号调节激酶（ERK1/2）的磷酸化