研究论文《hiv-1蛋白酶在裂殖酵母（schizosaccharomyces pombe）中的表达与功能研究》由Zsigmond Benko、Robert T. Elder、Ge Li、Dong Liang及Richard Y. Zhao等人完成，主要作者来自美国马里兰大学医学院病理学系、微生物学与免疫学系以及人类病毒学研究所，另有作者来自西北大学范伯格医学院芝加哥纪念教育与研究所。该研究于2016年3月16日发表在开放获取期刊《plos one》上。
该研究属于病毒学与细胞生物学交叉领域，重点关注hiv-1蛋白酶（protease，pr）与宿主细胞蛋白之间的相互作用及其对细胞增殖与存活的影响。hiv-1蛋白酶是天冬氨酸类蛋白酶，通常以同源二聚体形式存在，每个亚基由99个氨基酸组成。其主要功能是切割病毒gag-pol多聚蛋白前体，从而产生病毒复制所必需的结构蛋白与酶类，并促进感染性病毒颗粒的成熟。除了切割病毒蛋白外，越来越多的证据表明pr还能切割宿主细胞蛋白，诱导cd4+ t细胞等发生坏死或凋亡。然而，pr与宿主细胞蛋白相互作用的分子机制尚不清楚。为了在简单且与哺乳动物细胞功能相似的模式生物中系统研究pr的作用，作者选择了裂殖酵母作为研究体系。裂殖酵母在细胞周期调控、染色体生物学及细胞凋亡等方面与哺乳动物细胞具有诸多相似性，且此前已被成功用于研究hiv-1病毒蛋白r（vpr）的功能。
本研究的目标包括：构建可诱导表达hiv-1 pr的裂殖酵母菌株，验证pr在该体系中的酶活性是否与天然感染中一致，检测pr对裂殖酵母细胞增殖、氧化应激、线粒体形态及细胞死亡的影响，并进一步通过全基因组筛选寻找能够抑制pr毒性的宿主细胞蛋白，最后在哺乳动物细胞中验证所发现抑制因子的功能保守性。
在实验流程方面，研究者首先构建了裂殖酵母菌株re294。该菌株在染色体nmt1基因位点整合了单个hiv-1 pr基因拷贝，并利用可诱导的nmt1启动子控制其表达。在含有硫胺素（thiamine）的培养基中启动子被抑制（基因关闭），移除硫胺素后约14至16小时启动子被完全激活（基因开启）。通过western blot确认，在基因诱导24小时后可检测到约12 kda的pr蛋白条带。研究者随后通过液体培养生长曲线和琼脂平板集落形成实验，比较了pr表达与不表达条件下细胞的增殖能力。结果显示，pr开启细胞在诱导16小时后停止生长，而在琼脂平板上，pr开启后几乎无集落形成，18小时时存活集落形成率降至20%以下。
为了探究pr诱导的细胞死亡机制，研究采用酵母活/死细胞活力检测试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ros）特异性荧光染料二氢乙锭（dhe）以及线粒体特异性荧光探针daspmi，分别检测细胞代谢状态、氧化应激水平和线粒体形态。结果表明，pr表达24小时后，酵母细胞从橙红色（代谢活跃）转变为黄绿色（代谢惰性），提示细胞死亡；pr表达细胞中检测到强烈的红色ros荧光，而在pr抑制细胞中几乎未见；此外，pr表达细胞的线粒体由正常的管状网络沿细胞周边分布变为随机聚集的异常形态。这些结果提示pr诱导的细胞死亡具有类似凋亡的特征。
为验证上述效应确实由pr酶活性介导，研究者使用了fda批准的pr特异性抑制剂茚地那韦（indinavir，idv）。在含不同浓度idv的pr诱导平板上，集落形成随idv浓度增加而恢复，在100 μg/ml idv处理下液体培养中的细胞生长完全恢复。同时，idv预处理可逆转pr引起的ros产生、线粒体形态异常及细胞死亡，说明这些细胞毒效应源于pr的蛋白酶活性。
为直接证明pr在裂殖酵母中具备与天然hiv-1感染相同的酶切特异性，研究者开发了一种绿色荧光蛋白（gfp）再定位检测系统。他们构建了三种gfp融合蛋白：gfp-ma-vpr、gfp-p6-vpr和gfp-lf-vpr。其中ma和p6连接肽分别包含hiv-1 pr的天然切割位点dsqny#pivq和dsfnf#pqit，而lf连接肽包含炭疽芽孢杆菌致死因子蛋白酶的底物序列（作为阴性对照）。由于hiv-1 vpr蛋白在裂殖酵母中主要定位在核膜上，未切割的融合蛋白会在核膜上呈现环状结构（“vpr型”），而pr切割后gfp与vpr分离，导致gfp均匀分布于整个细胞（“gfp型”）。结果显示，pr表达20小时后，gfp-ma-vpr和gfp-p6-vpr融合蛋白均从“vpr型”转变为“gfp型”，表明pr特异性地切割了ma和p6位点；而gfp-lf-vpr仍保持“vpr型”，说明pr不能切割lf底物。进一步在gfp-p6-vpr体系中加入不同浓度的idv，发现随着idv浓度从2 μg/ml增加到100 μg/ml，呈“gfp型”的细胞比例逐渐下降，证明idv以剂量依赖方式抑制pr酶切活性。
为了寻找宿主细胞中能抑制pr功能的蛋白质，研究者在re294菌株中进行了全基因组多拷贝抑制子筛选。他们使用覆盖裂殖酵母全基因组的cdna文库转化re294细胞，在pr诱导平板上筛选恢复集落形成的转化子。在约40,000个转化子中初筛获得11个候选克隆，经回转入亲本菌株验证后有10个能抑制pr毒性。对这10个质粒测序发现，它们均携带hhp2基因的不同cdna片段。hhp2编码一个约45.83 kda的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于酪蛋白激酶1（ck1）家族。为了验证hhp2的抑制功能，研究者将hhp2克隆到pyz1n载体中，但由于nmt1启动子完全诱导hhp2对细胞有毒，故在培养基中添加1 nm硫胺素以降低表达水平。在此条件下，pr与hhp2共表达时可部分恢复集落形成。在gfp-p6-vpr切割实验中，共表达hhp2使pr介导的“gfp型”细胞比例在诱导后不同时间点降低了20%至50%，表明hhp2能抑制pr的蛋白酶活性及pr诱导的细胞死亡。
最后，研究者在哺乳动物细胞中检验了hhp2的功能保守性。利用人宫颈癌hela细胞系，通过pires2-egfp-pr质粒表达hiv-1 pr，以annexin v染色和流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示pr表达24小时后凋亡细胞比例从13.45±1.48%升高至30.98±10.33%。同时western blot检测到pr表达细胞中出现约41 kda的caspase-8特异性切割片段casp8p41以及切割型caspase-3产物，这与hiv-1 pr在感染cd4+ t细胞中诱导凋亡的特征一致。利用pcdna3.1载体在hela细胞中表达酵母hhp2基因，经rt-pcr确认其转录。通过台盼蓝染色和annexin v染色检测，发现hhp2共表达使pr诱导的细胞死亡比例从21.23±2.56%降至7.76±2.61%，凋亡比例从19.88±6.34%降至7.10±3.51%。western blot分析显示hhp2还减少了pr引起的caspase-3和caspase-8的切割。这些数据表明酵母hhp2激酶在哺乳动物细胞中同样能抑制hiv-1 pr诱导的细胞死亡和凋亡。
本研究的结论是：hiv-1蛋白酶在裂殖酵母中具有功能性酶活，并且其酶切特异性和诱导细胞死亡的特性与在哺乳动物细胞及天然感染中高度相似。pr在裂殖酵母中通过其蛋白酶活性抑制细胞增殖、诱导氧化应激、改变线粒体形态并最终导致细胞死亡，而所有这些效应均可被pr特异性抑制剂idv阻断。此外，通过全基因组筛选鉴定的hhp2激酶是一种新型pr抑制因子，能够抑制pr介导的蛋白切割和细胞死亡，并在哺乳动物细胞中表现出相同功能。这一发现为理解pr与宿主细胞蛋白的相互作用提供了新线索。
该研究的科学价值在于首次证明hiv-1 pr能在裂殖酵母中作为活性酶发挥与天然感染中一致的功能，并构建了可应用于机制研究和药物筛选的平台。由于裂殖酵母具有培养简便、成本低、无需活病毒操作等优势，该系统可用于高通量筛选针对hiv-1蛋白酶的新型抑制剂，尤其是针对耐药性突变的药物开发。此外，hhp2作为pr抑制因子的发现提示其哺乳动物同源物ck1α可能参与pr介导的凋亡信号通路，为后续研究hiv-1致病机制和宿主防御机制提供了新方向。