关于《使用新开发的多孔氧化锆颗粒纯化抗糖缀合物单克隆抗体》的研究报告

作者及发表信息

本研究由来自日本产业技术综合研究所（AIST） 生物生产研究所的 Tetsuya Okuda，NGK Spark Plug–AIST 医疗材料合作研究实验室的 Katsuya Kato 和 Masahiro Kitamura，以及日本特殊陶业株式会社（NGK Spark Plug Co., Ltd.） 的 Shinjiro Kasahara 共同完成。该研究成果于2021年发表在《Scientific Reports》期刊（卷 11，文章号 3233）。

学术背景与研究目的

本研究属于生物分离与纯化技术以及抗体工程与应用领域。研究的直接动因源于针对抗糖缀合物单克隆抗体（Monoclonal Antibodies against Glycoconjugates），特别是免疫球蛋白M（IgM） 类抗体高效纯化方法的迫切需求。

背景知识如下： 1. 糖缀合物（Glycoconjugates，如糖脂和糖蛋白） 在生物学中至关重要，针对其糖类抗原表位的抗体，尤其是在癌症治疗、诊断和干细胞标记等领域具有巨大应用潜力。然而，哺乳动物免疫系统对这类抗原的识别方式导致产生的抗体通常以IgM为主，而不是更常见的IgG。 2. IgM纯化是一大技术挑战。当前最主流的蛋白A/G亲和层析法依赖于与抗体Fc区域的结合，但IgM由于形成寡聚体结构，其Fc区域与蛋白A/G的亲和力很低，因此该方法不适用于IgM纯化。其他替代方法如沉淀、离子交换、尺寸排阻色谱等，在纯度、抗体活性回收率、步骤复杂性、成本以及规模化潜力方面均存在局限。商品化的IgM纯化系统也存在稳定性、结合容量或需要苛刻洗脱条件（如强酸性缓冲液）等问题，后者可能损害抗体功能。 3. 前期研究基础：已有研究表明，经N,N,N’,N’-乙二胺四（亚甲基膦酸）（EDTPA） 修饰的氧化锆微球可以选择性地与免疫球蛋白相互作用，并能从杂交瘤培养上清或人血清中分离抗体。然而，这些氧化锆颗粒普遍存在蛋白吸附容量低的问题，且修饰后的氧化锆是否影响所纯化抗体的抗原反应活性尚不明确。

因此，本研究的主要目标是：开发并评估一种新型的、经EDTPA表面修饰的、具有约10纳米孔径的多孔氧化锆颗粒（PZPs），旨在建立一种简单、高效、且能保持抗体活性的广谱抗体（特别是难纯化的抗糖缀合物IgM）纯化方法。

详细研究流程

本研究是一个系统的开发与验证过程，包括PZPs材料的制备、纯化方法的建立、以及对不同抗体的纯化效果、功能保持和机理的详细评估。

1. PZPs材料的开发与表征：研究团队设计并制备了孔径约10纳米的多孔氧化锆颗粒（PZPs）。孔径大小被设计为近似一个Ig单体的大小，旨在促进PZPs与免疫球蛋白的选择性相互作用。颗粒表面通过EDTPA进行化学修饰，该化合物的膦酸基团与氧化锆表面的路易斯酸位点结合，赋予其与免疫球蛋白选择性结合的特性。颗粒的平均粒径约为50微米，但拥有巨大的比表面积（133.46 m²/g），显著提升了蛋白吸附容量。同时，研究中也使用了未经EDTPA修饰的PZPs（PZPs(-)）以及一种已报道的EDTPA修饰氧化锆材料（Rhinophase-AB）作为对照。

2. 基于PZPs的抗体纯化流程建立（以PA5克隆为例）：研究首先以分泌小鼠抗GB4Cer（一种糖鞘脂）IgM（κ轻链） 的杂交瘤PA5克隆的培养上清为模型。具体流程如下：

   • 预处理：由于高盐浓度会抑制抗体与PZPs的结合，首先将含10%胎牛血清（FBS）的培养上清透析并浓缩于10 mM磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.0）中。
   • 吸附：将浓缩后的样品与20 mg PZPs混合，在室温下旋转孵育2小时。PZPs通过简单的沉淀法进行分离。
   • 洗涤：用10 mM PB（pH 7.0）洗涤PZPs两次，以去除未结合或非特异性结合的杂质蛋白。
   • 洗脱：使用较高浓度的PB（通常为100-500 mM，pH 8.0）孵育PZPs，将吸附的抗体洗脱下来。洗脱条件（PB浓度）根据具体抗体进行优化。
   • 分析与定量：收集各步骤（未吸附、洗涤、洗脱）的样品，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 和免疫印迹分析蛋白组成和抗体分布，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA） 试剂盒定量IgM含量，计算回收率和纯度。

3. PZPs纯化方法的普适性验证：

   • 研究对象扩展：研究使用了多个不同的杂交瘤克隆，生产不同类型的抗体，以验证PZPs的广谱适用性。这些抗体包括：抗GB4Cer的IgG3（PA4.2克隆）、具有不同抗原反应特异性的另一种抗GB4Cer的IgM（PA7克隆）、以及识别α2,6-唾液酸乳糖胺（α2,6-sialyl LacNAc） 修饰糖蛋白/糖脂的IgM（FR9克隆）。这些抗体的可变区结构不同，用于测试PZPs是否主要与抗体的恒定区相互作用。
   • 实验操作：对这些克隆的培养上清，采用相同的基本PZPs纯化流程，但系统性地测试了使用不同浓度（100、200、500 mM）的PB（pH 8.0）进行顺序洗脱，以确定每种抗体的最佳洗脱条件。
   • 其他类型抗体测试：为了验证PZPs对含不同轻链和来源的抗体的适用性，研究还测试了从腹水中纯化商业化的、含λ轻链的小鼠IgM（MOPC104e）。

4. 纯化后抗体的功能与特异性评估：

   • 抗原反应性：对每个抗体在主要洗脱组分中的样品，进行ELISA分析。将纯化后的抗体进行系列稀释，与包被其特异性抗原（如GB4Cer或胎球蛋白-Fetuin）的微孔板反应，并与原始杂交瘤上清的抗体反应性进行对比。
   • 抗原特异性：为了评估纯化过程是否影响抗体的特异性，研究设计了交叉反应实验。将纯化的抗体与结构相似的多种糖缀合物（如GB3Cer、GG3Cer、α2,3-唾液酸乳糖胺等）进行ELISA反应，检测其是否仅与目标抗原结合。

5. PZPs作用机制探究：

   • EDTPA修饰的作用：通过比较使用PZPs（EDTPA修饰） 和PZPs(-)（未修饰） 对PA5 IgM进行纯化的结果，评估EDTPA修饰对纯化效率和选择性的影响。通过SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA定量以及尺寸排阻-高效液相色谱（SEC-HPLC） 分析洗脱组分的蛋白组成、抗体回收率及纯度。
   • 孔结构的作用：通过比较PZPs与另一种EDTPA修饰但比表面积小得多的材料Rhinophase-AB，评估孔结构对IgM结合容量的影响。通过测量比表面积（BET模型）和纯化回收率来证实孔结构的重要性。

主要研究结果

1. PZPs对小鼠抗GB4Cer IgM（PA5）的高效纯化：使用PZPs和基于沉淀的简单方法，能有效纯化PA5 IgM。SDS-PAGE和免疫印迹结果显示，原始培养上清中IgM含量极低（含大量FBS蛋白），而经PZPs纯化后，在洗脱组分中IgM成为主要蛋白条带。ELISA定量数据显示，超过99%的杂质蛋白被去除，约50%的IgM被回收在100 mM PB洗脱组分中。当使用200 mM PB洗脱时，抗体回收率略有提高（~59%），但杂质蛋白含量也相应增加。

2. PZPs纯化方法具有广谱适用性：

   • 对于PA4.2 IgG3，其在100 mM PB中洗脱回收率差，但主要在200 mM PB洗脱组分中被回收，回收率达45%。
   • 对于PA7 IgM，其在100 mM和200 mM PB洗脱组分中均有回收。
   • 对于FR9 IgM，其主要在200 mM和500 mM PB洗脱组分中被回收。
   • 对于MOPC104e IgM（λ轻链），其在100 mM PB洗脱组分中回收率高达67%，总回收率可达96%。
   • 关键结论：所有测试的抗体，无论其类别（IgM或IgG）、轻链类型（κ或λ）、或抗原特异性，都能通过优化洗脱条件（PB浓度）被PZPs有效纯化，且纯度都很高（去除>99%杂质蛋白）。这表明PZPs不与抗体的可变区特异性结合，可能主要通过与恒定区相互作用来捕获抗体，是一种广谱的免疫球蛋白纯化介质。

3. PZPs纯化不影响抗体功能：

   • 抗原反应性：所有经PZPs纯化的抗体均保留了与原始上清中抗体相当的甚至有时更高的抗原结合活性。ELISA结果显示，部分纯化后抗体的反应曲线优于原始上清，推测可能是因为纯化过程去除了培养上清中可能存在的、含有相似糖类结构的抑制剂（来自FBS的糖蛋白/糖脂）。
   • 抗原特异性：交叉反应ELISA证实，纯化后的所有抗体均保持了其高度特异性，仅与其目标抗原强烈反应，而与结构相似的糖缀合物无明显交叉反应。这证明PZPs纯化过程不会改变抗体的特异性构象。

4. EDTPA修饰和孔结构是PZPs高效纯化的关键：

   • EDTPA修饰的作用：对比实验显示，使用PZPs(-) 纯化PA5 IgM时，尽管SDS-PAGE显示也能洗脱出蛋白，但IgM的回收率（~25%）远低于使用PZPs（~52%）。这表明EDTPA修饰的膦酸基团显著增强了PZPs与IgM的结合能力或选择性。
   • 孔结构的作用：Rhinophase-AB虽然能获得纯度更高的IgM（SEC-HPLC显示纯度约84%），但其IgM回收率更低（~29%）。PZPs和PZPs(-)的比表面积（~133 m²/g）远高于Rhinophase-AB（~9.9 m²/g）。这表明，约10纳米孔径的设计极大增加了比表面积，从而提升了抗体的结合容量，是提高回收率的关键因素。
   • 作用机制推断：膦酸基团修饰使PZPs表面带负电，而血清中主要杂质蛋白如牛血清白蛋白（BSA）是酸性蛋白，与PZPs存在静电排斥；相反，免疫球蛋白是碱性蛋白，与带负电的磷酸基团有静电吸引。孔径设计（~10 nm）大小恰好匹配一个Ig单体，可能通过空间位阻效应进一步增强了选择性。两者的结合使得PZPs能特异、高效地吸附免疫球蛋白。

研究结论与价值

本研究成功开发了一种基于新型多孔氧化锆颗粒（PZPs） 的抗体纯化方法。该方法具有以下显著特点和价值： 1. 广泛适用性：能够高效纯化多种免疫球蛋白，包括传统方法难以纯化的IgM，以及IgG。不受抗体类别、亚类、轻链类型或动物来源的限制，为纯化具有重要应用前景的抗糖缀合物IgM提供了一种通用工具。 2. 高效性与简便性：基于沉淀的操作流程简单，无需复杂层析设备。PZPs具有高结合容量，能有效去除超过99%的杂质蛋白，并获得约50%或更高的抗体回收率。 3. 功能友好性：使用中性pH范围的磷酸盐缓冲液进行洗脱，避免了传统蛋白A/G亲和层析中常用的强酸性洗脱条件，从而最大程度地保持了纯化后抗体的天然构象、抗原反应活性和特异性。 4. 经济与规模化潜力：PZPs是无机材料，相较于基于蛋白质配体（如蛋白A/G/L）的亲和介质，生产成本可能更低，稳定性更高，更有利于工业规模的抗体生产。

研究亮点

1. 材料的创新设计：将约10纳米的孔径（匹配Ig单体大小）与EDTPA表面修饰（引入选择性结合的磷酸基团）相结合，创造性地开发出一种兼具高选择性、高吸附容量和温和洗脱特性的新型纯化介质。
2. 解决了特定领域的技术瓶颈：专门针对抗糖缀合物IgM这类重要但难以纯化的抗体，提供了一种有效解决方案，直接推动了相关基础研究和应用开发。
3. 机理与应用相结合的研究：不仅验证了PZPs的纯化效果，还通过系统的对照实验（EDTPA修饰、孔结构、不同抗体类型）深入探究了其作用机制，为材料的进一步优化和更广泛的应用奠定了理论基础。
4. “一石多鸟”的纯化策略：该方法突破了现有纯化技术对特定抗体Fc区域的依赖，为所有免疫球蛋白提供了一种可能的通用纯化平台，具有重要的方法论意义。

其他有价值内容

研究也指出，PZPs纯化过程中主要的杂质蛋白是BSA，这对多数免疫检测应用影响不大。然而，对于一些要求极高的应用（如制药），可能需要进一步去除这些杂质。SEC-HPLC分析发现，PZPs（而非PZPs(-)）会特异性地吸附并洗脱下一些非Ig的蛋白，表明这些蛋白可能与膦酸基团有相互作用。未来通过鉴定这些蛋白的身份，可以进一步优化PZPs的表面化学性质，以提升纯化产物的最终纯度，拓展其在制药等高端领域的应用。总体而言，本研究开发了一种独特的、有前景的抗体纯化工具，有望广泛应用于科研、诊断和生物制药领域。