关于白色念珠菌中氟康唑耐受性介质鉴定与表征研究的学术报告

本文介绍的研究由洛桑大学医院微生物学研究所的Eric Delarze等人主导，并于2020年11月11日发表于《Frontiers in Microbiology》期刊（卷11，文章ID 591140）。研究的共同作者来自多个知名研究机构，包括瑞士洛桑大学医院、洛桑大学计算生物学系、法国巴黎巴斯德研究所真菌生物学与致病性研究组、巴黎公立医院系统Necker-Enfants Malades医院，以及瑞士Resistell AG、Abionic SA和Philip Morris Product SA等机构的相关研究人员。通讯作者为Dominique Sanglard。

一、 学术背景与研究目标

该研究属于医学微生物学与抗真菌药理学交叉领域，重点关注机会性致病真菌——白色念珠菌的耐药性与耐受性问题。白色念珠菌是院内感染，特别是重症监护病房感染的重要病原体，由其引发的侵袭性念珠菌病死亡率居高不下。氟康唑是临床最常用的抗真菌药物之一。既往研究对抗氟康唑的“耐药性”机制（如靶酶ERG11突变、药物外排泵过表达等）已有深入探索。然而，临床上存在一类分离株，它们在体外药敏测试中表现为“敏感”（MIC值低于临床折点），但在治疗中疗效不佳。这类菌株能在高于其MIC的氟康唑浓度下仍然维持一定水平的生长，这一现象被称为“耐受性”。与“耐药性”不同，耐受性通常不伴随MIC值的永久性升高。耐受性被认为能够延长真菌在药物压力下的存活时间，从而为获得真正的耐药性突变提供机会，并可能导致治疗中断后的感染复发。

尽管耐受性现象具有重要的临床意义，但其分子机制尚未被充分阐明。主要原因在于缺乏一个标准、简便且高效的方法来鉴定和量化临床分离株中的耐受性水平。因此，本研究旨在解决两大核心问题：1) 建立并优化一套可用于临床分离株的氟康唑耐受性鉴定与量化方法；2) 利用正向遗传学筛选策略，系统地鉴定并表征白色念珠菌中介导氟康唑耐受性的关键基因及其作用通路，以期揭示耐受性的分子基础。

二、 详细研究流程与方法

本研究包含一个清晰、多步骤的流程，结合了表型筛选、遗传学操作和转录组学分析。

第一步：氟康唑耐受性鉴定与量化方法的建立及在临床分离株中的大规模应用。 研究团队首先参照欧洲抗菌药物敏感性试验委员会和临床实验室标准化协会的标准微量稀释法，优化了耐受性测试条件。他们提出并定义了一个“耐受性指数”——TI。TI的计算方式为：在固定氟康唑浓度（8 µg/mL，高于临床敏感折点4 µg/mL）下，菌株相对于无药对照的相对生长百分比除以100。基于对已知耐药/敏感菌株的表型分析，研究者设定了初步的TI阈值：TI ≤ 0.2视为野生型敏感株；0.2 < TI < 0.8视为耐受株；TI ≥ 0.8则通常与已知的耐药机制相关。 为验证此方法并探索耐受性表型的多样性，研究者对一个包含181株临床来源白色念珠菌的集合进行了大规模筛选。测试在不同pH值下进行。结果显示，耐受性表型是菌株依赖性和pH依赖性的，可以分为五大类别：广谱耐药株、pH特异性耐受株、仅在酸性pH下耐受株、野生型敏感株以及仅在碱性pH下耐受株。这一复杂的表型谱提示氟康唑耐受性可能涉及多种不同的机制。

第二步：通过基因过表达策略筛选氟康唑耐受性介质。 为了系统地发现与耐受性相关的基因，研究采用了正向遗传学方法。他们利用了一个由Christophe d‘Enfert实验室构建的、包含572株白色念珠菌的诱导型过表达菌株集合。该集合中，每个菌株携带一个特定基因（主要为转录因子、蛋白激酶/磷酸酶等），其表达受强力霉素诱导调控。每个菌株还含有一个独特的20bp条形码，便于在混合培养中进行追踪。 筛选策略是“混合池富集实验”：将这572株菌混合后，在含有高浓度氟康唑（32 µg/mL）和/或强力霉素的培养基中连续传代培养5天，每天更换新鲜药物培养基以维持选择压力。培养结束后，通过高通量测序分析各菌株条形码在最终群体中的丰度变化。与无药对照或仅有氟康唑的条件相比，在“强力霉素 + 氟康唑”条件下被显著富集的菌株，其过表达的基因被认为可能赋予对氟康唑的耐受性或增强的生存优势。 为排除混合培养中可能存在的菌株间相互作用（“池效应”）的干扰，研究者还对集合中的菌株进行了“单菌株耐受性分析”，直接比较每个菌株在有无强力霉素诱导下，于高浓度氟康唑中的生长情况。 结合混合池富集和单菌株分析的结果，研究者筛选出一系列候选基因。其中，过表达后能显著提高TI值（使其超过0.2的耐受性阈值）的两个转录因子基因——CRZ1和GZF3被确定为最重要的候选耐受性介质。

第三步：候选基因在遗传背景明确的实验室菌株和临床耐受株中的功能验证。 研究者首先在实验室菌株背景下进行了深入的功能研究。他们构建了crz1和/或gzf3的敲除突变体、回复突变体，并分别在野生型及突变体背景下诱导过表达CRZ1或GZF3。通过测定这些菌株的MIC和TI值，他们发现： 1. 过表达效果：在野生型背景中过表达CRZ1或GZF3均能显著提高TI值，但不影响MIC，这与耐受性表型相符。 2. 基因交互作用：在gzf3单敲除突变体中过表达CRZ1或GZF3仍能提高耐受性；然而，在crz1单敲除或crz1/gzf3双敲除突变体中，过表达GZF3则无法提高耐受性，而过表达CRZ1依然有效。这提示CRZ1可能位于GZF3的下游，或者CRZ1是GZF3发挥功能所必需的。 为确认这些基因在天然耐受性中的作用，研究者在四株具有不同耐受性水平的临床分离株中，分别敲除了CRZ1和/或GZF3基因。结果显示，敲除CRZ1在所有测试的临床分离株中都能一致性地、显著地降低其氟康唑耐受性水平。而敲除GZF3仅在部分菌株中引起较小程度的耐受性下降。这一关键证据确立了CRZ1在维持临床菌株氟康唑耐受性中的核心作用。

第四步：对耐受性水平不同的临床分离株进行转录组学分析。 为了从全基因组层面探究耐受性菌株在氟康唑压力下的反应特征，研究者选择了三株具有遗传相关性但耐受性水平不同的临床分离株（来自同一患者的系列分离株），以及实验室参考株SC5314，进行RNA测序分析。比较它们在有无氟康唑处理条件下的基因表达谱。 基因集富集分析揭示了一个重要模式：在氟康唑耐受性较高的临床菌株中，响应氟康唑而上调的基因集合，与已知的“钙调磷酸酶通路”和“CRZ1靶基因”集合存在显著重叠。这一转录组“印记”强烈表明，在这些耐受性临床分离株中，钙信号通路（以钙调磷酸酶及其下游转录因子CRZ1为核心）被氟康唑应激显著激活。这从全基因组表达水平上，与前述遗传学证据相互印证，共同指向钙调磷酸酶-CRZ1通路在介导氟康唑耐受性中的关键角色。

三、 主要研究结果与逻辑关系

1. 建立并验证了基于TI的氟康唑耐受性定量方法：该方法能够有效区分野生型敏感株、耐受株和耐药株。对181株临床菌株的筛选证实了耐受性表型的多样性和复杂性，为后续机制研究提供了表型分类基础。
2. 通过遗传筛选鉴定出两个关键的耐受性介质：CRZ1和GZF3：混合池富集和单菌验证相结合的策略，从572个候选基因中成功筛选出这两个转录因子。它们在过表达时能赋予实验室菌株明显的耐受性表型。
3. 确立了CRZ1在临床耐受性中的核心作用：在多种遗传背景的临床分离株中进行基因敲除实验，是本研究的关键环节。结果一致表明，敲除CRZ1能有效削弱临床菌株固有的耐受性，而敲除GZF3的效果则不那么显著和普遍。这直接将CRZ1与临床相关表型联系起来，超越了在实验室模型菌株中的发现。
4. 转录组学揭示了耐受性菌株的钙调磷酸酶通路特征：对系列临床分离株的RNA-seq分析发现，耐受性更高的菌株在氟康唑应激下，其钙调磷酸酶-CRZ1信号通路相关基因的表达特征更为明显。这从分子表型上解释了为何CRZ1的功能如此重要，并将耐受性与一个已知的应激响应通路直接关联。 这些结果之间存在清晰的逻辑递进关系：首先建立表型量化方法→利用该方法筛选出候选基因→在实验室菌株中验证候选基因功能→在临床菌株中确认核心基因（CRZ1）的生理重要性→通过转录组学揭示核心基因所属通路在耐受性菌株中被激活，从而构建了一个从表型到基因，再到通路的完整证据链。

四、 研究结论与价值

本研究得出以下核心结论： 1. 成功开发了一套基于标准微量稀释法的、简便有效的氟康唑耐受性鉴定与量化方案（TI指数），为临床和科研中系统研究真菌药物耐受性提供了实用工具。 2. 通过系统的过表达筛选，鉴定出转录因子CRZ1和GZF3是白色念珠菌氟康唑耐受性的正调节因子。 3. CRZ1是维持临床分离株氟康唑耐受性的关键因子，其缺失会显著降低多种耐受性临床菌株的耐受水平。 4. 转录组学分析表明，具有高水平氟康唑耐受性的临床分离株在药物应激下表现出强烈的钙调磷酸酶通路激活特征，进一步证实了该通路在耐受性机制中的中心地位。

本研究的科学价值在于，它首次通过大规模、系统的遗传筛选结合临床菌株验证，明确地将CRZ1及其所在的钙调磷酸酶通路确立为白色念珠菌临床氟康唑耐受性的核心分子基础之一。这深化了我们对“药物耐受性”这一不同于经典“耐药性”的生存策略的理解。其应用价值体现在：首先，所建立的TI测定方法有助于未来在临床分离株中更精细地评估耐受性风险。其次，CRZ1和钙调磷酸酶通路作为关键的耐受性介质，为开发新的抗真菌联合治疗策略提供了潜在的靶点。例如，将氟康唑与钙调磷酸酶抑制剂（如环孢素A）或该通路其他组分的抑制剂联用，有望克服由耐受性导致的治疗失败，将氟康唑从抑真菌剂转化为杀菌剂。

五、 研究亮点

1. 方法学创新：建立了标准化的、可量化的氟康唑耐受性体外检测方案（TI指数），填补了该领域方法学的空白，促进了不同研究间数据的可比性。
2. 系统性的筛选策略：巧妙地将包含572个基因的条形码过表达菌株库、混合池富集筛选与单菌验证相结合，高效地从全基因组尺度筛选耐受性相关基因。
3. 临床相关性聚焦：研究并未止步于实验室模式菌株的发现，而是将核心候选基因（CRZ1）在多个具有天然耐受性的临床分离株中进行功能验证，使其发现具有更强的临床意义和说服力。
4. 多维度证据整合：研究整合了表型分析（大规模筛选）、正向遗传学（过表达筛选与敲除验证）和转录组学（RNA-seq）多种技术手段，从不同层面相互印证，使得“钙调磷酸酶-CRZ1通路是氟康唑耐受性关键介质”这一结论坚实可靠。
5. 对pH依赖性的探讨：研究观察并详细描述了氟康唑耐受性对培养基pH值和菌株遗传背景的依赖性，揭示了这一表型的复杂性，提示未来研究需考虑环境因素与基因型的互作。

六、 其他有价值的内容

研究还讨论了氟康唑耐受性pH依赖性与既往文献报道不一致的可能原因，指出培养基成分（RPMI vs YPD）和菌株遗传背景可能是重要变量。这一讨论体现了研究的严谨性。此外，研究确认了之前报道中提及的钙调磷酸酶通路在耐受性中的作用，并通过大规模筛选和临床验证为其提供了新的、更系统的证据支持。研究也暗示，除CRZ1外，GZF3或其他候选基因可能在特定条件下或通过与其他因子互作来调节耐受性，这为未来更深入的机制研究留下了空间。