学术研究报告：熟地黄水提物通过恢复细胞内铁稳态改善肝脏缺血再灌注损伤

第一作者及单位
本研究由北京中医药大学生命科学学院的Zhang Yinhao、Jia Kexin、Li Yufei等共同完成，通讯作者为Li Xiaojiaoyang教授。研究成果发表于2024年9月的《Chinese Journal of Natural Medicines》（Elsevier出版），DOI:10.1016/s1875364(24)60719-3。

学术背景
肝脏缺血再灌注损伤（hepatic ischemia/reperfusion injury, HIRI）是肝切除和移植术后的常见病理生理现象，可导致肝功能恶化甚至衰竭。近年研究发现，铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖的程序性细胞死亡形式）在HIRI中起关键作用。熟地黄（Rehmanniae Radix Praeparata, RRP）是传统中药，具有肝保护、抗炎和抗氧化特性，但其通过调控铁死亡缓解HIRI的机制尚不明确。本研究旨在揭示RRP水提物通过调节铁代谢稳态改善HIRI的作用机制。

研究流程与方法
1. RRP水提物的化学表征
- 采用高效液相色谱（HPLC）鉴定RRP水提物的主要成分，包括类叶升麻苷（acteoside）、地黄苷D（rehmannioside D）和5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural）。

1. 体内实验：HIRI小鼠模型

   • 动物分组：C57BL/6J小鼠分为假手术组、HIRI模型组及低、中、高剂量RRP干预组（2.5、5、10 g/kg），每组6只。
     
   • 手术操作：通过夹闭肝门静脉和肝动脉90分钟诱导缺血，再灌注6小时。
     
   • 检测指标：
     
     • 血清ALT、AST、LDH、NO水平；肝组织MDA、GSH含量。
       
     • 组织病理学（H&E染色）、细胞凋亡（TUNEL法）、铁沉积（普鲁士蓝染色）。
       
     • 转录组测序（RNA-seq）分析差异表达基因（DEGs），重点筛选铁死亡相关通路（如HAMP、ZIP14、CISD1等）。
       

2. 体外实验：MCT和erastin诱导的肝细胞损伤模型

   • 细胞处理：BRL肝细胞系预孵育RRP水提物（50、100、150 μg/mL）后，分别用MCT（模拟HIRI）和erastin（铁死亡诱导剂）刺激。
     
   • 检测指标：
     
     • 细胞活力（CCK-8法）、ROS生成（DCFH-DA荧光染色）、铁离子浓度（总铁和Fe²⁺检测试剂盒）。
       
     • 通过siRNA敲低HAMP基因，验证其与RRP的协同作用。
       

3. 分子机制分析

   • Western blot：检测ZIP14、Hepcidin、FPN等铁代谢相关蛋白表达。
     
   • 免疫荧光：观察Hepcidin核转位及ZIP14膜定位。
     
   • 功能验证：通过GSEA和KEGG富集分析揭示RRP调控的铁死亡通路。
     

主要结果
1. RRP改善HIRI小鼠肝损伤
- RRP显著降低血清ALT、AST水平（P<0.01），减少肝组织坏死和炎症浸润（H&E染色）。 - 转录组分析显示，RRP上调GPX4、CISD1等抗铁死亡基因，下调ZIP14、HAMP等促铁死亡基因（log2FC>0.5，FDR<0.05）。

1. RRP调控铁代谢稳态

   • RRP抑制ZIP14介导的铁摄取，促进FPN依赖的铁外排（Western blot验证）。
     
   • siRNA敲低HAMP后，RRP对铁死亡的抑制作用进一步增强（GSH升高30%，MDA降低50%）。
     

2. 线粒体保护作用

   • 透射电镜显示RRP维持线粒体膜完整性，减少铁聚集（P<0.001）。
     

结论与意义
本研究首次阐明RRP水提物通过以下机制缓解HIRI：
1. 靶向铁代谢：抑制ZIP14和Hepcidin，促进FPN和CISD1表达，恢复铁稳态。
2. 抗氧化与抗炎：降低ROS和MDA，提升GSH水平。
3. 临床价值：为HIRI的治疗提供了天然药物候选策略，尤其适用于肝移植术后保护。

研究亮点
1. 多维度验证：结合体内外模型、转录组学和分子生物学技术，系统解析RRP的作用机制。
2. 创新发现：揭示RRP通过HAMP/ZIP14/FPN轴调控铁死亡的新靶点。
3. 转化潜力：RRP成分明确（如地黄苷D），为后续药物开发奠定基础。

其他价值
本研究得到国家自然科学基金（82274186）和北京市科技计划（7212174）支持，实验方案通过北京中医药大学动物伦理委员会审批（批件未提供）。