研究报道：普马拉病毒感染引起的肾综合征出血热患者中先天性淋巴细胞被激活，其功能可受汉坦病毒诱导的Ⅰ型干扰素调控
本研究由以Karolinska Institutet的Marina García和Anna Carrasco García、Tampere大学的Jukka Mustonen和Satu Mäkelä以及Linköping大学的Jonas Klingström等为核心的多国多中心团队合作完成，相关成果于2024年7月22日发表于病原学领域的国际知名期刊 *PLOS Pathogens*。
该研究的学术背景聚焦于免疫学与病毒学的交叉领域，具体关注由汉坦病毒感染引起的急性人畜共患病——肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）。此前研究已知，汉坦病毒感染患者表现出强烈的全身性炎症和免疫细胞激活，特别是自然杀伤细胞（NK cells）在HFRS中高度活化。然而，作为固有免疫淋巴细胞家族另一重要成员的非NK先天性淋巴细胞（innate lymphoid cells, ILCs，以下简称非NK ILCs）在此类病毒感染中的作用尚不明确。ILCs在调控免疫和炎症反应中扮演重要角色，但在病毒感染背景下，尤其是对于非NK ILCs（包括ILC1、ILC2和ILC3）的应答特征和激活机制知之甚少。因此，本研究旨在系统性地表征HFRS患者外周血中ILC（包括NK细胞和非NK ILCs）的应答特征，并探索病毒诱导其激活的潜在机制，以期深化对汉坦病毒致病过程中免疫病理机制的理解。
本研究遵循了一套详尽而严谨的工作流程。首先，研究纳入了17名经血清学确诊为急性普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）感染引起的HFRS患者以及10名健康对照者。患者样本在疾病急性期（症状出现后5-8天）、早期恢复期（20-27天）和晚期恢复期（180或360天）分三个时间点采集。研究者对患者血浆进行了全面的可溶性因子分析，使用多重免疫分析法检测了19种细胞因子和趋化因子的水平，并通过RT-qPCR定量了血浆中的病毒载量。同时，利用18参数流式细胞术对患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的ILC和NK细胞进行了精细的表型分析。所使用的细胞鉴定策略（门控策略）是建立在领域内已确立方法基础上的改良方案，能够准确区分NK细胞（定义为Lin- CD3- CD45+ CD56+ CD127lo/hi）以及非NK ILCs（定义为Lin- CD3- CD45+ CD127hi），并进一步细分出初始ILC、ILC2（及其亚群c-kitlo ILC2和c-kithi ILC2）等亚群。所有流式数据的分析均采用盲法进行，以确保客观性。
其次，为了探究ILC在病毒感染中被激活的机制，研究团队设计并实施了一系列体外实验。他们从健康供体的PBMCs中分选并体外扩增了人ILC2。核心实验模型是将这些ILC2与PUUV感染的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行共培养，或将其暴露于感染或未感染内皮细胞的条件培养基中。通过比较ILC2的活化标志物（CD69）表达和细胞活力，来评估其是否被激活以及激活是否依赖于细胞接触。为了鉴定介导激活的关键因子，研究者采用了抗体/蛋白阻断实验，在将条件培养基用于刺激ILC2之前，预先用针对特定细胞因子（如IL-6、IL-12、IL-18）的阻断性抗体或针对Ⅰ型干扰素的诱饵受体蛋白B18R进行处理。此外，为了直接验证Ⅰ型干扰素（特别是IFN-β）对ILC2的影响，研究者用不同浓度的重组人IFN-β直接刺激ILC2，并分析其活化状态、存活率以及分泌的细胞因子谱（通过多重免疫分析法检测培养上清）。为了探索ILC2本身是否可能成为汉坦病毒的靶细胞，研究还进行了病毒感染实验，将ILC2直接暴露于不同感染复数（MOI）的PUUV，并在感染后不同时间点通过RT-PCR检测细胞内的病毒RNA水平。
数据统计分析方面，研究者运用了多种统计方法。组间比较（如患者不同阶段与对照）使用Kruskal-Wallis检验及Dunn‘s事后检验；患者不同时间点的配对比较使用Wilcoxon符号秩检验；体外实验不同处理组的比较使用配对t检验。相关性分析采用Spearman秩相关系数。此外，研究者还运用了主成分分析（PCA）来可视化样本基于可溶性因子谱或细胞表型谱的整体分布差异。所有分析均使用GraphPad Prism和R软件完成。
研究取得了多项重要且相互关联的结果。在第一部分临床样本分析中，研究者确认了HFRS急性期存在强烈的炎症反应。患者血浆中包括TNF、IL-6、IL-10、IFN-γ等16种细胞因子水平显著升高，其中IL-13、IL-25、IL-33、TSLP等与ILC2功能相关的2型细胞因子也显著增加。PCA分析显示急性期样本与恢复期样本明显分离。特别值得注意的是，急性期血浆IFN-γ水平与病毒载量呈显著正相关。
在淋巴细胞表型分析上，结果揭示了NK细胞和非NK ILCs的动态变化。NK细胞在急性期外周血中的频率显著降低，但存留的NK细胞呈现高度活化（CD69+、HLA-DR+比例增加）和增殖（Ki-67+比例增加）状态，且其活化程度与病毒载量正相关，而总NK细胞频率与病毒载量负相关。此外，NK细胞的归巢受体表达发生改变（如α4β7+减少，CCR6+和CCR10+增加），提示其可能向组织迁移。
对于非NK ILCs，其总频率在疾病过程中未发生显著变化，但其组成发生了改变：ILC2的频率在急性期增加，而初始ILC的频率则降低。更重要的是，ILC2的亚群分布发生偏移，向更成熟的、ILC2谱系定向的c-kitlo ILC2亚群倾斜。与非NK ILCs一致，总ILC和ILC2在急性期也表现出活化（CD69+）和增殖（Ki-67+）增强。与NK细胞类似，急性期总ILC的频率也与病毒载量呈显著负相关。
体外机制研究部分的结果为上述患者观察提供了可能的解释。研究发现，与PUUV感染的HUVECs共培养或其条件培养基，能够有效激活ILC2，表现为CD69表达上调，且这种激活不依赖于细胞间直接接触，是由可溶性因子介导的。通过阻断实验，研究者发现用Ⅰ型干扰素诱饵受体B18R预处理条件培养基，可以显著抑制其对ILC2的激活作用，而阻断IL-6、IL-12或IL-18则无此效果。这证实了PUUV感染内皮细胞后释放的Ⅰ型干扰素是激活ILC2的关键介质。进一步的验证实验显示，直接使用重组IFN-β刺激ILC2，能以剂量依赖的方式诱导其活化，并在一定范围内提高其存活率。尤为重要的是，IFN-β显著改变了ILC2的细胞因子分泌模式：它抑制了ILC2经典的2型细胞因子IL-5和IL-13的产生，同时促进了IL-10、CXCL10和GM-CSF的分泌。此外，初步的病毒感染实验提示，ILC2可能也是PUUV的潜在感染靶标，因为在部分供体的ILC2中检测到感染后病毒RNA的增加。最后，回到患者样本，研究证实急性期HFRS患者血浆中的IFN-α水平确实显著高于恢复期。
综合以上结果，本研究得出结论：在PUUV感染的HFRS患者中，外周血ILC（包括NK细胞和非NK ILCs）被广泛激活并发生增殖。疾病急性期伴随有ILC2（尤其是c-kitlo亚群）频率的增加，以及初始ILC频率的减少。病毒载量与循环中NK细胞和非NK ILCs的频率呈负相关，提示病毒复制可能影响这些细胞的分布。体外实验首次揭示，汉坦病毒通过感染内皮细胞诱导产生的Ⅰ型干扰素，能够非接触性地激活ILC2。此外，Ⅰ型干扰素（IFN-β）可以直接调控ILC2的功能，促使其从典型的2型细胞因子分泌模式向产生IL-10、CXCL10等因子的模式转变。这些发现表明，经典的抗病毒分子——Ⅰ型干扰素，在塑造HFRS等病毒性疾病中ILC的应答和功能方面发挥了此前未被充分认识的作用。
本研究的科学价值和应用意义显著。首先，它首次系统描绘了汉坦病毒感染中非NK ILCs的应答图谱，拓展了人们对病毒感染固有免疫应答复杂性的认识。其次，它揭示了Ⅰ型干扰素在连接病毒感染（内皮细胞）与固有淋巴细胞（ILC2）激活之间的新桥梁作用，为理解病毒感染引起的免疫病理和免疫调节提供了新视角。第三，发现ILC2的功能可被IFN-β重塑（如诱导IL-10产生），提示在特定病毒感染背景下，ILC2可能发挥超出传统2型免疫之外的调节或保护功能，这为探索针对过度炎症的干预策略提供了潜在靶点。
本研究的亮点在于：重要的发现包括明确了HFRS患者ILC2亚群的动态变化和激活状态，以及病毒载量与ILC频率的负相关关系；新颖的机制阐释在于首次证明了汉坦病毒通过诱导Ⅰ型干扰素来激活ILC2，并详细描述了IFN-β对ILC2细胞因子分泌谱的重编程作用；研究方法的综合性体现在结合了详尽的临床队列纵向分析（多时间点、多参数）与深入的体外机制探求（共培养、因子阻断、功能测定），形成了从现象到机制的完整证据链。此外，研究还提示了ILC2作为汉坦病毒潜在靶细胞的可能性，这是一个值得未来深入探究的方向。
最后，研究者也指出了本研究的局限性，例如主要关注外周血，未来对肺、肾等靶器官组织中ILC的研究将能更全面地揭示其在疾病局部的作用。同时，不同类型病毒诱导的Ⅰ型干扰素反应在强度和动力学上可能存在差异，它们对ILC功能产生的最终影响也需结合具体的感染背景和伴随的炎症环境来综合评估。