本文属于类型a，是一篇原创性的方法学论文。以下是根据该文档内容撰写的学术报告。

一、研究作者、机构与发表信息

本研究由Yasheng Yan、Thiago Arzua、Sarah Logan和Xiaowen Bai共同完成。第一作者Yasheng Yan与通讯作者Xiaowen Bai来自威斯康星医学院（Medical College of Wisconsin）细胞生物学、神经生物学与解剖学系（Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy），Thiago Arzua和Sarah Logan同时隶属于该校生理学系（Department of Physiology）。该研究以“Isolation and Culture of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoid Cells”为题，发表于Methods in Molecular Biology期刊，于2022年作为该丛书第2454卷的一部分正式出版（页码483–494），其电子版于2020年在线发布，DOI为10.¹⁰⁰⁷⁄₇₆₅₁_2020_328。

二、研究背景与目的

神经系统疾病近年来已成为全球范围内最主要的健康问题之一，其对患者生活质量造成严重影响。深入理解神经系统疾病的发病机制以及不同类型脑细胞在其中的贡献，对于开发新的治疗策略至关重要。长期以来，动物模型被广泛用于脑科学研究，用以预测人脑对药物和环境应激源的反应。然而，越来越多的证据表明，动物与人之间在大脑生理和遗传层面存在固有的物种差异，这严重限制了动物模型在人类神经系统疾病研究中的外推价值。因此，亟需建立保真度更高的人类大脑体外模型。

人类诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells, iPSCs）由体细胞（如成纤维细胞和尿液脱落细胞）重编程而来，具有无限增殖和分化为几乎所有细胞类型的能力。近年来，由Knoblich实验室率先开发的人iPSC来源的三维（three-dimensional, 3D）脑类器官（cerebral organoids）为在体外模拟人脑健康与疾病状态提供了前所未有的机会。与目前广泛使用的二维（2D）单层细胞培养相比，脑类器官能够形成多种皮层层次和多个脑区样结构，包含神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞等多种细胞类型，并在电活动、药物反应、组织异质性及细胞功能组成等方面更接近真实人脑。

然而，一些基于类器官的实验（如流式细胞术、电生理特性检测和单细胞RNA测序）需要使用解离后的单细胞。这些基于解离细胞的实验能够为理解不同脑细胞在生理和病理状态下的作用提供重要信息。因此，开发可靠的从脑类器官中分离、培养并维持脑细胞的方法显得尤为必要，尤其是对于研究细胞类型特异性信号转导、电生理特性及不同细胞类型对脑功能的贡献而言。本研究的目的正是提供一套从2个月月龄的人iPSC来源3D脑类器官中分离和培养脑细胞的操作方案（protocol），并证明所获细胞可表达神经元特异性标志物且具有自发电活动能力。

三、研究的详细工作流程

本研究建立了一个完整的脑类器官细胞分离与培养流程，主要包括四个核心步骤，即类器官的收集与清洗、组织解离、细胞吹打分散以及细胞接种与培养。

第一步：收集与清洗脑类器官。 研究所用的实验材料是人iPSC来源的2个月月龄的3D脑类器官。由于类器官体积相对较大，常规的1 mL移液枪头无法直接吸取，因此作者首先将枪头前段约1 cm处剪切掉，以获得更大的开口。使用改良后的枪头将类器官转移至含有Hank’s平衡盐溶液（Hank’s Balanced Salt Solution, HBSS）的15或50 mL离心管中，HBSS用量为每颗类器官2 mL。随后让类器官自然沉降到管底，再小心吸去全部HBSS，整个过程避免扰动组织。

第二步：组织解离。 向含有清洗后类器官的离心管中加入预先在37 °C温育的0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液，用量为每颗类器官3 mL。然后将离心管置于37 °C培养箱中消化120分钟，期间每10分钟轻摇离心管一次。消化结束后，加入等体积的神经元接种培养基（neuronal plating medium）以终止消化反应。

第三步：细胞吹打分散。 为了降解组织解离过程中由裂解细胞释放的细胞外DNA、防止细胞因黏连DNA而形成不必要的团块，作者向细胞悬液中加入DNase I储存液，终浓度为10 μL/mL。随后用10 mL血清移液管轻柔吹打组织10次，以打散较大的细胞团块；再用套有200 μL无棉塞枪头的10 mL血清移液管继续轻柔吹打10次，以分离较小的细胞团块。如需获得单细胞悬液（例如用于流式细胞术或单细胞RNA测序），可用40 μm细胞筛过滤细胞悬液，以去除未完全解离的细胞团块。之后在室温下以80 × g离心5分钟，弃去上清，用5 mL神经元接种培养基重悬细胞沉淀。

第四步：细胞接种与培养。 使用血细胞计数板对解离细胞进行计数。该方案可获得较高的活细胞产量，每颗类器官约可收获4 × 10⁶个细胞。将细胞接种于Matrigel包被的培养器皿中，用神经元接种培养基进行培养，6孔板中每孔培养基用量为2.6 mL。接种后3小时，将神经元接种培养基更换为神经元饲养培养基（neuronal feeding medium）。如需抑制胶质细胞等增殖细胞的生长，可在接种后24小时将一半旧培养基替换为神经元培养培养基（neuronal culture medium），其含有5 μM的阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside, Ara-C）。培养过程中每周更换两次培养基。作者指出，接种后第1天即可观察到神经突起，第6天可形成广泛的神经网络，部分细胞表达神经元特异性标志物微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2, MAP2），并表现出自发性动作电位。

在试剂准备方面，作者详细给出了DNase I储存液（5 mg/mL）、Ara-C储存液（5 mM）和Matrigel储存液（2 mg/mL）的配制方法。培养器皿需用80 μg/mL的Matrigel工作液包被，包被后的器皿在室温放置至少1小时方可使用，如不立即使用可密封后于4 °C保存不超过7天。培养基分为三种：神经元接种培养基（由Neurobasal培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素组成）、神经元饲养培养基（由Neurobasal培养基、B27补充剂、青霉素-链霉素和GlutaMAX组成）以及神经元培养培养基（在饲养培养基基础上加入Ara-C）。

四、主要实验结果

作者通过形态学观察、免疫荧光染色和电生理记录三个层面的实验，证明该方案能够成功从2个月月龄的脑类器官中获得可培养的脑细胞，并且这些细胞具有神经元特性和功能活性。

在细胞形态方面，解离后立即在血细胞计数板上观察到的细胞呈圆形、分散良好。培养6天后，相差显微镜下可见许多细胞表现出典型的神经元样形态，即具有小而圆的细胞体和伸出的长突起，并且已形成广泛的神经突起网络。这表明解离后的细胞能够在Matrigel包被的培养器皿中成功贴壁并生长分化。

在细胞标志物表达方面，免疫荧光染色结果显示，部分解离培养的细胞表达神经元特异性标志物MAP2，这从分子层面证实了所获细胞群体中包含具有神经元身份的细胞。

在电生理功能方面，作者将解离后的类器官细胞接种于含有多电极阵列（multiple electrode array, MEA）的培养孔中。结果显示，来自脑类器官的解离神经元能够产生自发性动作电位放电。实验记录了代表性的动作电位幅度，并统计了自发性放电频率。这一结果从功能层面证明，该分离培养方案不仅能够维持细胞存活，还能保留神经元的电生理活性，这对于后续的电生理特性研究和神经网络功能分析具有关键意义。

这些结果之间存在清晰的逻辑递进关系：首先通过形态学观察确定细胞能够贴壁和生长并形成神经突起网络，其次通过MAP2免疫荧光染色确认细胞群体中含有神经元，最后通过MEA记录证实这些神经元具备自发性电活动能力。三个层面的证据共同支持了该方案的有效性和可靠性。

五、研究结论与意义

本研究成功建立了一套从2个月月龄的人iPSC来源3D脑类器官中分离、培养并维持脑细胞的操作方案。整个类器官解离和细胞接种过程仅需3–4小时，所获细胞可在培养中维持至少3周。研究证明，该方案获得的细胞中部分表达神经元特异性标志物MAP2，并表现出自发性动作电位。

该研究的科学价值在于为脑类器官研究提供了一个关键的实验工具。脑类器官虽然能够较好地模拟人脑的三维结构和细胞多样性，但在许多下游分析中需要将其解离为单细胞。可靠且高效的单细胞分离和培养方案，是进行流式细胞术、单细胞RNA测序、细胞类型特异性信号通路研究和电生理特性检测的前提。本研究满足了这一方法学需求。在应用价值方面，该方案可服务于神经发育疾病、病毒感染（如寨卡病毒和COVID-19）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）等脑类器官疾病模型的后续细胞功能研究，也可用于药物神经毒性和治疗效果的评估。

六、研究亮点

本研究的亮点主要体现在三个方面。其一是操作的实用性和可重复性。作者对类器官转移时枪头的大开口改良、DNase I的使用以抑制细胞聚集、以及Matrigel包被和培养基配方的详细说明，均为实际操作者提供了充分的细节保障。其二是对细胞功能活性的验证。研究不仅停留在细胞形态和标志物表达层面，还通过多电极阵列记录证实了解离培养后的神经元具有自发性动作电位，证明该方案在维持神经元电生理功能方面具有可靠性。其三是对不同下游应用的兼容性。方案中明确指出，如需单细胞悬液可用于流式细胞术或单细胞RNA测序，如无需单细胞悬液则可省略过滤步骤，体现了方案的灵活性和广泛适用性。

七、其他有价值的内容

在操作注意事项中，作者特别强调了以下几点：胰蛋白酶-EDTA消化液使用前需在37 °C水浴或培养箱中预热30分钟；整个实验过程中需轻柔处理类器官组织和解离细胞，这是获得高质量解离细胞的关键；培养基如需长期保存可先分装并冻存于−20 °C，解冻后应在2周内用完且不可再次冻存；Matrigel在融化、稀释和操作过程中必须始终置于冰上以防止胶凝；推荐类器官解离时间为120分钟，但应根据类器官的月龄、大小和具体应用优化解离条件；吹打过程中应避免产生气泡，吹打次数应控制在20次以内；更换培养基时应使用移液管而非真空抽吸系统；培养细胞应在接种后21天内使用，长期培养可能导致细胞聚集或从培养器皿上脱落。这些注意事项进一步增强了方案的可操作性和结果的可重复性。