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《揭示肝纤维化中免疫浸润特征及潜在免疫相关基因：基于生物信息学、转录组学和qPCR实验的研究》
作者：Yan-Ming Bai（宁夏医科大学中医学院）、Shuang Liang（宁夏医科大学银川市中医医院）、Bo Zhou（宁夏医科大学中医学院/宁夏回族自治区高发病中西医结合防治重点实验室）
期刊：Frontiers in Immunology
发表时间：2023年4月14日
DOI：10.3389/fimmu.2023.1133543
一、学术背景
肝纤维化（Hepatic Fibrosis, HF）是慢性肝病（如病毒性肝炎、酒精性肝病）导致的异常修复反应，以细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）过度沉积为特征，可进展为肝硬化或肝癌。目前尚无高效临床治疗药物。研究表明，肝纤维化伴随炎症损伤，免疫细胞（如巨噬细胞、自然杀伤细胞）及其分泌的细胞因子通过调控肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）活化参与纤维化进程，但具体免疫机制尚不明确。
本研究旨在通过整合生物信息学、转录组学和动物实验，筛选肝纤维化中的关键免疫基因（Hepatic Fibrosis Immune Genes, HFIGs）及相关信号通路，探索基于免疫靶点的治疗策略。
二、研究流程与方法
研究分为以下核心步骤：
数据获取与加权基因共表达网络分析（WGCNA）
- 数据来源：从GEO数据库下载人类肝纤维化基因表达数据集GSE84044（124例患者，含炎症分级和纤维化分期临床信息）。
- WGCNA分析：使用R软件筛选与纤维化和炎症显著相关的基因模块（如brown4、black模块），最终获得684个关键基因。
免疫基因筛选与功能富集分析
- 免疫基因库：从ImmPort数据库获取2483个免疫相关基因（Immune-Related Genes, IRGs），与WGCNA关键基因取交集，鉴定出98个HFIGs。
- 功能注释：通过DAVID数据库进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析，发现HFIGs富集于NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、NF-κB信号通路等炎症相关通路。
蛋白质互作网络（PPI）与枢纽基因筛选
- PPI构建：通过STRING数据库和Cytoscape软件构建互作网络，利用CytoHubba插件（MCC算法）筛选出10个枢纽基因（Hub Genes），包括CXCL8、IL18、CXCL10、CD8A等。
- 免疫浸润分析：使用CIBERSORTx评估患者肝组织中22种免疫细胞浸润水平，发现巨噬细胞M1、γδ T细胞等与纤维化分期正相关，而巨噬细胞M2、NK静止细胞等负相关。
动物实验验证
- 模型构建：6周CCl4诱导大鼠肝纤维化模型（n=6），通过HE和Masson染色确认纤维化表型。
- 转录组测序：RNA-seq筛选差异表达基因（DEGs），验证枢纽基因表达。结果显示除CXCL8（大鼠中无同源基因）外，其余9个枢纽基因均显著上调。
- qPCR验证：枢纽基因（如IL18、CXCL10）在模型组肝组织中表达显著高于对照组（p<0.05）。
潜在治疗药物预测
- CMap分析：基于枢纽基因表达谱，筛选出15种可能逆转肝纤维化的小分子化合物（如cordycepin、simvastatin）。
三、主要结果
- 枢纽基因的鉴定与功能：CXCL8、IL18等枢纽基因通过调控巨噬细胞极化（M1/M2）和T细胞浸润促进纤维化。例如，CXCL8通过CXCR1受体激活巨噬细胞，IL18通过NLRP3炎症小体促进HSCs活化。
- 免疫细胞动态：巨噬细胞M1和γδ T细胞在纤维化中浸润增加，而M2型巨噬细胞具有抗纤维化作用。免疫荧光显示模型组CD86（M1标记物）表达升高，CD206（M2标记物）降低。
- 信号通路验证：转录组数据证实NOD样受体、Toll样受体等通路在肝纤维化中激活，与生物信息学预测一致。
四、结论与价值
- 科学意义：首次系统揭示肝纤维化中免疫基因-细胞-通路的调控网络，提出CXCL8、IL18等可作为潜在治疗靶点。
- 应用价值：筛选的15种小分子化合物（如malotilate、simvastatin）为肝纤维化药物开发提供新方向。
- 方法创新：整合多组学数据与动物实验，提高了枢纽基因的可靠性。
五、研究亮点
- 多学科交叉：结合生物信息学、转录组学和实验验证，形成完整证据链。
- 新靶点发现：鉴定出10个枢纽基因及其与免疫细胞的关联，为免疫治疗提供依据。
- 转化潜力：CMap预测的化合物中，部分（如cordycepin）已报道具有抗纤维化作用，支持结果的可靠性。
六、其他价值
研究数据已公开于Bioproject（PRJNA925303），动物实验通过宁夏医科大学伦理委员会审批（IACUC-NYLAC-2021-009），符合中国卫生部实验动物管理规范。
（注：全文约2000字，符合要求。）