本研究由 Liuqi Peng、Isaak Decoene、Hanna Svitina 和 Ioannis Papantoniou 共同完成，通讯作者为 Ioannis Papantoniou，研究团队来自比利时鲁汶大学（KU Leuven）的 Prometheus 骨骼组织工程转化研究部和骨骼生物学与工程研究中心。该研究于 2026 年发表于 Advanced Materials 期刊。
深层骨软骨缺损（osteochondral defect）的修复在临床上仍然面临巨大挑战。关节软骨本身缺乏自我修复能力，而骨软骨单元又要求关节软骨和软骨下骨（subchondral bone）实现既整合又分区的再生。目前临床常用的微骨折术和自体软骨细胞移植术（ACI）往往生成机械性能较差的纤维软骨，骨软骨同种异体移植则受限于供体稀缺和免疫排斥。一项涵盖 1861 例患者的荟萃分析显示，现有手术干预对膝关节深层骨软骨缺损的长期失败率高达 38.1%。基于支架的组织工程方法虽有所进展，但面临水凝胶降解过快、聚合物力学不匹配、多相支架界面分层等问题。近年来，类器官（organoid）策略为无支架构建提供了新思路，但大多数方法仍依赖外部材料且缺乏对分区分化的空间控制。诱导多能干细胞（iPSC）来源的软骨细胞（iChon）能生成抗肥大的稳定透明软骨，但现有 iPSC 策略多聚焦于软骨再生，忽视了软骨下骨形成的同步需求。为此，本研究提出一种无支架的模块化策略，将 iChon 类器官与人骨膜来源细胞（hPDC）类器官进行空间生物装配，构建分区化骨软骨组装体（assembloid），以期实现关节软骨与软骨下骨的协同修复。
研究整体包含体外构建与表征、体内原位移植评估以及转录组学分析三大阶段。
第一阶段：iChon 大团块（iChonmass）的分化与表征。 研究以人 iPSC 为起点，采用已建立的两步法方案：先用 CHIR99021 和 FGF-2 进行中胚层诱导，再用视黄酸和 FGF-2 处理，随后在含 TGF-β1、BMP-2、GDF-5 等因子的成软骨培养基中分化。至第 8 周形成直径约 2–3 mm 的 iChonmass。基因表达分析显示 SOX9 在第 6 周上调 117 倍，ACAN 和 COL2A1 在第 8 周分别达到约 3354 倍和 7859 倍的表达峰值，而 COL10A1 始终受抑制。皮下移植 8 周后，纳米 CT 和组织学染色证实 iChonmass 维持软骨样形态且无矿化结构。
第二阶段：三类类器官的形成与表征。 将 iChonmass 酶解为单细胞，与商品化的人关节软骨细胞（hAC）和 hPDC 分别接种至非黏附 AggreWell800 微孔板中，培养 21 天形成类器官。iChon 类器官第 21 天平均投影面积为 0.067 mm²，显著小于 hAC（0.217 mm²）和 hPDC（0.137 mm²）。免疫荧光和二次谐波（SHG）成像显示 hPDC 类器官在第 7 天有增殖峰，iChon 类器官第 21 天外周 SHG 信号增强。组织学染色显示 iChon 和 hAC 类器官有更均匀的糖胺聚糖（GAG）沉积，hPDC 则较低。RT-qPCR 分析证实 hPDC 类器官中 COL10A1、RUNX2、OSX 和 COL1A1 显著上调，呈肥大软骨表型；iChon 和 hAC 维持低肥大/成骨基因表达。蛋白水平上，三类类器官均含丰富的 II 型胶原（Col II），hPDC 则显著富集 I 型胶原（Col I）和 X 型胶原（Col X），iChon 的 Col II/Col I 面积比最高。
第三阶段：分区化组装体的顺序生物装配。 利用 3D 打印 PDMS 模具制备 2 mm 直径的琼脂糖大孔，先将第 21 天的 iChon 或 hAC 类器官作为软骨层种子，融合 24 小时后，再将 hPDC 类器官作为骨层种子于其上，继续融合 24 小时，体积装载比为 1:5。组织学分析显示 iChon+hPDC 组装体中软骨层呈致密 GAG 富集基质，hPDC 层在偏振光镜下呈更有序的胶原排列，界面区呈现过渡性基质特征。hAC+hPDC 组装体虽保持分层结构，但软骨层 GAG 沉积较弱，界面区基质连续性较差。
第四阶段：大鼠全层骨软骨缺损模型中的体内评估。 在免疫缺陷大鼠股骨滑车沟建立直径 1.6 mm、深度约 1.6 mm 的全层骨软骨缺损。先评估单组分构建体：hPDC-only 植入 8 周后显著提高了缺损区骨体积分数（BV/TV），但软骨区恢复有限；iChon-only 植入 16 周后维持了稳定的软骨表型且 Ki67 阳性细胞极少。随后将双组分组装体（iChon+hPDC、hAC+hPDC）植入 16 周，以缺损不处理为阴性对照、对侧未手术膝为健康对照。采用宏观评分（ICRS）、纳米 CT 三维重建与定量分析、H&E、SafO/FG、AB/NFR 组织学染色、改良 O’Driscoll 组织学评分、IHC 和免疫荧光进行综合评价。此外还通过 Sirius Red 偏振光显微镜结合 ImageJ 方向性插件定量分析胶原纤维各向异性。
第五阶段：转录组学分析。 对第 21 天的 iChon、hAC、hPDC 类器官及 8 周 iChonmass 进行 bulk RNA 测序，每组 3 个生物学重复。使用 DESeq2 进行差异表达分析（FDR < 0.05，|log2FC| > 2），通过 Enrichr 进行基因本体（GO）富集分析。
体外结果： iChon 和 hAC 类器官均形成以 Col II 为主的软骨样基质，但只有 iChon 类器官随时间推移呈进行性 COL2A1 表达升高且 GAG 沉积更均匀；hPDC 类器官则呈现明确的肥大软骨表型（Col I/Col X 显著富集），支持其作为骨模块的定位。在组装体层面，iChon+hPDC 的界面区 GAG 和胶原染色读数介于双层之间，呈现渐变过渡；hAC+hPDC 则缺乏这种渐变特征，界面连续性较弱。
体内结果： 16 周时，iChon+hPDC 组在宏观 ICRS 评分上显著高于缺损对照组，且与天然组织无显著差异。纳米 CT 定量显示 iChon+hPDC 组的 BV/TV 显著高于缺损对照组（p < 0.05），与天然组织相当；但骨小梁线性密度（Tb.Li.Dn）显著低于天然组织，骨小梁厚度（Tb.Th）则高于天然组织，提示修复区骨小梁微结构仍较粗疏，处于持续重塑阶段。组织学染色显示 iChon+hPDC 组在表层修复区呈现更致密且更接近软骨的细胞组织，AB/NFR 和 SafO/FG 染色阳性区域比 hAC+hPDC 组更广泛、更均一。改良 O’Driscoll 评分中，iChon+hPDC 组在细胞形态、基质染色、结构完整性和软骨厚度等维度均显著优于 hAC+hPDC 和缺损对照组。
蛋白标志物定位： 在 iChon+hPDC 组中，PRG4/lubricin 免疫反应性更集中地出现在关节表面区域，其下方为 Col II 富集基质，提示表层区表型的部分重建。Col I 主要分布于深部区，Col X 主要见于修复缺损的深部区域，OPN 和 OCN 信号集中于软骨下区，TRAP 阳性细胞沿骨小梁/软骨下表面分布，证实 16 周时深部区仍存在活跃的骨重塑过程。
胶原各向异性： 天然软骨浅层约有 32.74% 的胶原纤维分布在 −10° 至 0° 的表面平行参考方向范围内；iChon+hPDC 组达到 36.87%，显著高于 hAC+hPDC 组（16.84%）和缺损对照组（17.72%）。在深部骨区，iChon+hPDC 组的纤维取向分布也最接近天然软骨下骨。深度分辨分析显示 iChon+hPDC 组在一定程度上再现了从表层到深层的胶原取向层次。
转录组学结果： PCA 显示四类细胞群聚类明显分离。hPDC 中 COL10A1、SPP1、IBSP 等肥大/早期成骨基因高度上调，GO 富集于骨骼系统发育和骨形成通路。iChon 中 PRG4 表达受限于关节软骨表型，同时富集于 ECM 重塑、信号素–丛蛋白信号及 Wnt 信号负调控等通路，并高表达早期祖细胞标志物（GREM1、CXCL12、PDGFRB）和前胶原 N-肽酶 ADAMTS14。hAC 则表现出与稳态相关的 p38-MAPK 信号富集和较低增殖/BMP 相关信号。
本研究证明了通过空间引导的谱系特异性类器官模块组装，可以实现无支架、生物分区化的骨软骨构建体的生成。iChon+hPDC 组装体在全层骨软骨缺损模型中支持了透明软骨样修复，同时伴随空间异质性的软骨下骨重塑。该构建体部分恢复了天然骨软骨单元的关键组成和结构特征，包括胶原各向异性的部分重建，且软骨形成模块在体内保持稳定。
科学价值： 该研究提供了一套以发育工程学为原则的无支架设计框架，将两种不同谱系命运的类器官作为“活性可编程构建单元”，通过自组织基质介导形成界面连续性，而非依赖外部支架或人工梯度。这一设计理念为复杂骨骼组织界面的工程化构建提供了新范式。
应用价值： 与当前临床常用方法相比，该策略旨在单个植入体内实现软骨与软骨下骨的协同再生。iChon 模块提供了稳定的透明软骨表型，hPDC 模块通过软骨内成骨途径支持骨相修复。值得注意的是，将 iPSC 来源细胞仅用于软骨相而将原代细胞用于骨相的双细胞构型，在转化层面降低了 iPSC 总量相关的安全性负担和制造复杂性。此外，iChonmass 解离为单细胞后再聚集成小型类器官的策略，使得 iPSC 来源的稳定软骨表型可转化为尺寸可控、可模块化装配的构建单元，为个性化骨软骨治疗提供了可能。
第一，首次将 iPSC 来源的稳定软骨类器官与 hPDC 来源的肥大软骨类器官通过顺序融合方式在无支架条件下构建分区化骨软骨组装体，界面过渡由细胞自身基质组织行为自然涌现。第二，iChonmass 的可解离-再聚集策略解决了以往 iPSC 大团块缺乏几何适应性的转化瓶颈。第三，通过胶原纤维取向的定量分析证明 iChon+hPDC 组装体在体内部分恢复了表面平行方向的胶原各向异性，这一结果显著优于 hAC 对照组和缺损组。
研究在免疫缺陷大鼠中进行，未反映宿主免疫系统在关节修复中的作用，未来需要在免疫健全模型中验证。16 周时间点下软骨下骨区仍表现为持续重塑但未完全成熟，需要更长观察期并引入步态分析等直接功能终点。培养基差异（iChon 使用 CM1，hAC/hPDC 使用 CM2）可能影响对比结果，系统性培养基交叉实验有助于进一步优化。未来的自动化生物打印技术和体外动态力学加载有望增强该组装体平台的可扩展性与成熟度。