本研究由深圳大学先进技术学院（SUAT）的Zhongyun Xie与Jianming Liao（共同第一作者）及Keqiang Ye（通讯作者）领导的团队完成，合作单位包括武汉大学人民医院和浙江省医院。该研究于2026年发表在学术期刊 Bone Research 上，文章标题为“C/EBPβ dictates postmenopausal FSHβ transcription and blockade of AEP/C/EBPβ pathway alleviates osteoporosis”。
一、 学术背景与目的
本研究主要聚焦于骨代谢与内分泌学领域，特别是绝经后骨质疏松症的发病机制。绝经后女性体内的卵泡刺激素水平急剧上升。既往研究证实，FSH可通过激活其受体FSHR，直接促进破骨细胞介导的骨吸收，从而导致骨量丢失，这一过程独立于雌激素水平的下调。同时，课题组前期工作发现，在阿尔茨海默病模型中，FSH可以激活C/EBPβ（CCAAT/增强子结合蛋白β）和天冬酰胺内肽酶通路，促进神经退行性变。然而，C/EBPβ/AEP通路是否会对FSH的合成进行反馈性调节，并进而影响其促骨丢失作用，此前尚不清楚。
基于此，本研究旨在探究以下核心科学问题：C/EBPβ能否作为转录因子直接调控垂体腺中FSHβ亚基的基因转录？抑制AEP/C/EBPβ通路能否通过下调FSH水平来缓解骨质疏松？研究目标是通过分子、细胞及动物模型，阐明C/EBPβ在FSH转录中的关键作用，并评估其特异性AEP抑制剂#11a在治疗绝经后骨质疏松中的治疗潜力。
二、 详细研究流程与方法
本研究采用了多层次、多系统的研究策略，从分子机制到动物模型疗效验证，流程严谨。
第一阶段：C/EBPβ调控FSHβ表达的体内外验证 * 研究对象与处理： 1. 基因敲除小鼠模型： 使用野生型、C/EBPβ杂合敲除和AEP完全敲除的雌性小鼠。小鼠在12周龄时接受假手术或卵巢切除术。术后分析垂体中FSHβ、C/EBPβ、AEP等蛋白和mRNA水平。 2. 原代垂体细胞模型： 分离培养大鼠原代垂体细胞。通过慢病毒转染技术，分别过表达或敲低细胞中的C/EBPβ。细胞接受促性腺激素释放激素处理或对照处理。 * 实验方法： 1. 分子生物学技术： 使用蛋白质印迹和定量逆转录聚合酶链反应分析蛋白和mRNA表达变化。通过染色质免疫沉淀技术、荧光素酶报告基因实验和电泳迁移率变动分析，直接验证C/EBPβ与FSHβ基因启动子区域的结合活性及转录调控功能。 2. 雌激素调控实验： 为了模拟OVX后雌激素缺失的环境，研究在无酚红培养基中使用 charcoal-stripped血清培养原代垂体细胞，并添加雌激素，观察其对C/EBPβ介导的FSHβ转录的调节作用。
第二阶段：AEP抑制剂#11a对OVX诱导的骨质疏松的治疗作用评估 * 研究对象与处理： 1. 药物治疗动物模型： 对OVX后的野生型雌性小鼠进行为期3个月的长期灌胃给药。设置四组：假手术+溶剂、OVX+溶剂、OVX+AEP抑制剂#11a、OVX+TRKB受体激动剂CF3CN。后者作为阳性对照，用于比较直接抑制AEP与通过激活神经营养通路间接抑制AEP这两种策略的差异。在后续实验中，还引入了FDA已批准的抗骨质疏松药物特立帕肽（PTH 1-34）作为另一阳性对照。 * 实验方法： 1. 内分泌与分子检测： 使用ELISA测定血清和垂体中FSH和LH水平；通过蛋白质印迹和qRT-PCR分析垂体中C/EBPβ、AEP、FSHβ及相关信号通路分子的变化。特别检测了垂体中TRKB受体的表达，以解释TRKB激动剂为何不能降低FSH。 2. 骨形态与骨密度分析： 使用显微计算机断层扫描扫描离体股骨，定量分析骨小梁体积分数、骨小梁数量、厚度、分离度等三维结构参数。通过双能X线吸收测定法测量全身和局部骨密度和骨矿含量。 3. 骨组织形态计量学： 对股骨进行石蜡切片，进行H&E染色观察骨髓脂肪和骨小梁形态；进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色定量破骨细胞数量与表面覆盖度；通过钙黄绿素双标荧光动态观察骨形成速率。 4. 组织免疫化学： 对脑组织和骨组织进行免疫荧光或免疫组化染色，观察FSHR、C/EBPβ和AEP在OVX及药物治疗后的表达与定位变化。
第三阶段：细胞水平机制探究——成骨与破骨分化 * 研究对象与处理： 1. 成骨细胞模型： 使用小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1。在成骨诱导培养基中培养，并加入BDNF、CF3CN、7,8-DHF或#11a进行干预，评估对成骨分化和矿化的影响。 2. 破骨细胞模型： 使用小鼠单核/巨噬细胞系RAW 264.7。使用RANKL诱导其向破骨细胞分化，并加入上述药物，评估对破骨细胞形成和骨吸收活性的影响。 3. 原代细胞验证： 从C/EBPβ杂合敲除小鼠中分离原代成骨前体细胞和单核细胞，进行体外分化实验，验证基因型与药物处理的联合效应。 * 实验方法： 1. 细胞功能学检测： 碱性磷酸酶染色和茜素红S染色分别用于评估MC3T3-E1细胞早期的成骨分化和晚期的钙结节矿化能力。TRAP染色用于鉴定RAW 264.7细胞分化为多核破骨细胞。体外骨吸收实验（在骨切片上培养）通过甲苯胺蓝染色观察骨吸收陷窝。 2. 信号通路与酶活检测： 通过蛋白质印迹分析细胞中TRKB/Akt/ERK、C/EBPβ/AEP、OPG/RANKL等关键通路蛋白及其磷酸化水平。使用荧光底物法检测AEP的酶活性。
三、 主要研究结果
结果一：C/EBPβ是FSHβ的关键转录激活因子。 体内实验发现，在OVX小鼠中，敲除C/EBPβ能显著降低垂体中FSHβ的蛋白和mRNA水平，但不影响LHβ。同样，敲除AEP也导致C/EBPβ和FSHβ水平下降。体外原代垂体细胞实验证实，敲低C/EBPβ可削弱GnRH诱导的FSHβ表达上调；而过表达C/EBPβ虽能基础性增加FSHβ，但在GnRH强烈刺激下反而表现出轻微的抑制作用。机制上，研究人员在FSHβ基因启动子区域鉴定出多个C/EBPβ潜在结合位点，其中位点1的结合活性最强。ChIP、EMSA和荧光素酶报告基因实验均证实C/EBPβ可直接结合到FSHβ启动子上，并驱动其转录。此外，雌激素处理可以部分拮抗C/EBPβ对FSHβ的转录激活作用，提示OVX后雌激素的缺失解除了对C/EBPβ-FSHβ轴的抑制。
结果二：AEP特异性抑制剂#11a可选择性降低OVX引起的FSH升高。 长期口服#11a能显著降低OVX小鼠血清和垂体中异常升高的FSH水平，而对LH水平无影响。与之形成对比，两种TRKB受体激动剂均未能降低FSH。机制探究发现，TRKB受体在垂体中几乎不表达，这解释了其激动剂无法在垂体水平调控FSH的原因。#11a的治疗同时抑制了垂体中C/EBPβ的活化和AEP的自激活成熟。此外，#11a还能降低OVX后在海马、内嗅皮层及骨组织中升高的FSHR表达。
结果三：#11a和CF3CN均能有效缓解OVX诱导的骨质疏松，但作用侧重点不同。 μCT和DXA分析显示，#11a和CF3CN治疗均能显著改善OVX导致的骨小梁微结构退化，提高骨密度和骨矿含量，效果相当。组织形态学分析证实，两者都能抑制OVX引起的骨转换亢进，降低破骨细胞数量，并改善动态骨形成参数。这表明二者在骨组织局部均能发挥有效的抗骨吸收和促骨形成作用。
结果四：细胞实验揭示#11a与CF3CN的差异化作用机制。 在MC3T3-E1细胞中，#11a和CF3CN都能促进成骨分化和矿化，并上调成骨关键转录因子Osterix和Runx2。同时，它们都抑制了C/EBPβ/AEP信号通路，并提高了护骨素水平。然而，只有CF3CN能激活经典的TRKB/Akt/ERK信号通路。在RAW 264.7细胞中，二者均能抑制RANKL诱导的破骨细胞生成、骨吸收活性和C/EBPβ/AEP通路激活。AEP酶活检测证实了药物的抑制作用。对C/EBPβ杂合敲除小鼠原代细胞的实验进一步支持了#11a通过抑制C/EBPβ/AEP通路来促进成骨、抑制破骨的观点。
结果五：#11a在抗骨质疏松疗效上与FDA批准药物特立帕肽相当。 头对头比较实验显示，口服#11a与皮下注射特立帕肽治疗8周后，在改善骨小梁结构参数、提高骨密度、减少骨髓脂肪和降低破骨细胞数量方面，疗效相似。这为#11a作为一种潜在的新型口服抗骨质疏松药物提供了强有力的临床前证据。
四、 研究结论与意义
本研究得出以下核心结论：1. C/EBPβ是绝经后状态下垂体FSHβ基因转录的关键直接调控因子。 2. AEP/C/EBPβ通路形成正反馈环路，AEP的激活能稳定并增强C/EBPβ的活性，进而促进FSH合成。 3. 靶向抑制AEP（使用#11a）能有效打破这一环路，下调FSH水平，并同时在骨组织局部抑制破骨、促进成骨，从而发挥强大的抗骨质疏松作用。 4. #11a在动物模型中展现出与标准治疗药物特立帕肽相当的疗效，具有转化为临床应用的潜力。
其科学价值在于，首次系统地阐明了C/EBPβ/AEP信号轴在绝经后FSH异常升高中的核心转录调控作用，揭示了骨质疏松与神经系统疾病（如阿尔茨海默病）可能存在共享的内分泌-信号通路机制。应用价值在于，发现AEP抑制剂#11a是一个能同时作用于“中枢（垂体，降低FSH）”和“外周（骨组织，直接调节骨代谢）”的双重功能候选药物，为开发治疗绝经后骨质疏松及其相关并发症的新型疗法提供了全新的靶点和先导化合物。
五、 研究亮点