基于NanoBRET技术研究活细胞中RNA-蛋白质相互作用及其小分子抑制的学术报告

一、 研究团队与发表信息 本研究的主要作者包括Jingsong Shan, Amirhossein Taghavi, Elizabeth A. Caine, Ryuichi Sekioka, Veronika Rajchin, James M. Burke, J. Monty Watkins, Jessica L. Childs-Disney，以及通讯作者Matthew D. Disney*。该团队主要来自美国Scripps研究所的Matthew D. Disney实验室。这项原创性研究以题为“A Live-Cell NanoBRET Assay to Monitor RNA–Protein Interactions and Their Inhibition by Small Molecules”的论文形式，于2025年9月25日在线发表于《ACS Central Science》期刊（2025年卷11期，第2154-2171页）。该论文遵循CC-BY 4.0开放获取许可。

二、 学术背景与研究目的 本研究属于化学生物学与RNA生物学交叉领域，聚焦于由异常RNA-蛋白质相互作用引起的疾病机制研究与治疗策略开发。

• 科学背景： RNA与蛋白质的相互作用（RNA-protein interactions, RPIs）在包括翻译、前体mRNA（pre-mRNA）选择性剪接、转录后修饰和RNA稳定性在内的众多细胞过程中至关重要。其失调与多种疾病相关，例如强直性肌营养不良1型（myotonic dystrophy type 1, DM1）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）。在DM1中，致病机理源于肌营养不良蛋白激酶（DMPK）基因3‘非翻译区（3’ UTR）中CUG三核苷酸重复序列的异常扩增，形成富含1×1 UU内部环的稳定RNA二级结构[即r(CUG)exp]。这种结构化的重复RNA能够高亲和力地结合并“扣押”（sequester）肌肉盲样蛋白1（muscleblind-like 1, MBNL1）——一个关键的pre-mRNA选择性剪接调节因子。MBNL1的功能丧失导致广泛的剪接失调，是DM1的核心细胞表型。

• 研究动机与挑战： 尽管已有多种方法（如CLIP、CHIRP、CHART等）用于研究RPIs，但它们通常涉及繁琐的体外操作步骤，可能无法准确反映活细胞内动态、瞬时的相互作用。因此，亟需开发一种能够在生理相关环境下实时监测RPIs并进行高通量筛选的工具。

• 研究目标： 本研究的核心目标是开发并验证一种基于纳米生物发光共振能量转移（nano-bioluminescence resonance energy transfer, NanoBRET）的活细胞检测方法，用以特异性监测DM1致病核心——r(CUG)exp与MBNL1之间的毒性相互作用。在此基础上，利用该平台筛选能够破坏此相互作用的小分子化合物，并评估这些分子在DM1患者来源细胞模型中挽救疾病相关病理表型（剪接缺陷和核内病灶形成）的能力。

三、 详细研究流程 研究流程主要分为四个阶段：NanoBRET检测平台的构建与优化、平台验证、基于平台的小分子筛选与鉴定、以及小分子在DM1疾病模型中的功能验证。

第一阶段：NanoBRET检测平台的构建与优化

1. 研究设计与细胞模型选择：

   • 原理设计： 利用r(CUG)exp RNA作为支架，将分别标记了Nanoluc荧光素酶（供体）和Halotag（受体，可结合外源荧光配体）的两个MBNL1蛋白拉近至BRET有效距离（约5纳米）以内，从而产生能量转移信号。当相互作用被破坏时，信号减弱。
   • 蛋白构建体设计： 为避免MBNL1自身二聚化干扰，使用了C端截短（去除外显子6和7）的MBNL1。设计了四种融合蛋白：MBNL1-Nanoluc、Nanoluc-MBNL1、MBNL1-Halotag、Halotag-MBNL1（图3a）。
   • 细胞模型： 选用稳定表达一个野生型等位基因[r(CUG)0]和一个含有480个中断CUG重复[24个串联的(CUG)20(CUCGA)模块]的突变等位基因[r(CUG)480]的Hela细胞系（Hela480）。该细胞系已表现出DM1的细胞病理特征。

2. 平台优化过程：

   • 融合蛋白方向优化： 在Hela480细胞中共转染不同组合的供体/受体融合蛋白质粒，通过对比背景信号和经反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO；CAG25 vivo-morpholino）敲低r(CUG)exp后的信号降低窗口（window size），确定最优组合为C端融合的MBNL1-Nanoluc和MBNL1-Halotag。
   • 质粒比例优化： 系统调整两种质粒的转染比例（从1:10到1:200）。最终选择1:50（MBNL1-Nanoluc : MBNL1-Halotag）的比例，因其在提供约13.5毫BRET单位（mBU）信号窗口的同时，供体发光信号强度（~1×10^5 RLU）处于NanoBRET检测的最佳范围内。
   • 对照实验： 确认信号特异性，排除了非特异性相互作用（如仅Halotag或仅Nanoluc与MBNL1融合蛋白组合）和细胞背景（野生型Hela细胞无信号）的干扰。
   • 实验方法细节： 实验中使用了细胞外Nanoluc抑制剂以确保只检测细胞内信号；使用Halotag NanoBRET 618配体；通过双滤光片（供体460/80 nm，受体610 nm长通）在酶标仪上读取发光信号，并计算校正后的NanoBRET比率。

第二阶段：平台验证

1. 使用已知工具分子验证：

   • 反义寡核苷酸（ASO）验证： 使用靶向r(CUG)exp的CAG25 vivo-morpholino（通过空间阻断作用）和CAG16 gapmer（通过招募RNase H降解RNA）处理细胞。两者均能剂量依赖性地显著降低NanoBRET信号，且信号降低程度与通过等位基因特异性RT-qPCR测得的r(CUG)480 RNA丰度下降高度相关（皮尔逊相关系数r=0.98），证明了信号与靶标RNA丰度及相互作用的直接关联。
   • 小分子验证： 使用一个已知的MBNL1结合小分子处理细胞，也能引起NanoBRET信号下降，表明该检测也能报告通过作用于蛋白端破坏复合物的情况。

2. 细胞表型关联验证：

   • 单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）与免疫荧光（IFA）成像： 在Hela480细胞中，证实了MBNL1-Nanoluc与r(CUG)exp在核内病灶中共定位。经ASO处理后，共定位的病灶数量和强度均显著减少，这与NanoBRET信号降低的读数一致，从形态学上验证了检测的功能相关性。
   • 高通量筛选适用性评估： 在96孔板格式下计算该检测的Z’因子为0.63，表明其非常适合用于高通量筛选（HTS）。

第三阶段：小分子筛选与作用机制初探

1. 小分子库与筛选：

   • 化合物来源： 基于已知RNA结合分子的结构特征和理化性质，通过分子指纹和聚类分析，从一个大型化合物库（约10亿个）中初选出1957个，再经溶解度和类药性预测，最终得到72个小分子组成的聚焦库进行筛选。
   • 初步筛选： 在Hela480细胞NanoBRET检测中，以50 μM浓度对这72个化合物进行三轮筛选。筛选标准为NanoBRET信号降低值超过所有测试化合物平均值的1个标准差（σ）。共鉴定出10个活性化合物（“命中物”）。

2. 命中物表征：

   • 剂量反应与化学型分类： 对10个命中物进行剂量反应测试，测定其半数抑制浓度（IC50），范围在~16 μM 至 >50 μM。这些分子可被归类为两个主要化学型家族（A型和B型）。
   • 体外相互作用验证： 使用已建立的基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的体外检测方法，验证所有10个化合物均能剂量依赖性地破坏r(CUG)12与MBNL1的复合物形成。
   • 作用靶点鉴定：
     • 差示扫描荧光法（DSF）： 使用FAM标记、BHQ淬灭的r(CUG)10 RNA探针进行DSF实验。结果显示，10个化合物中的8个能引起RNA熔解温度（Tm）发生剂量依赖性变化，表明它们直接结合RNA。而使用MBNL1蛋白和SYPRO Orange染料的DSF实验中，仅1个化合物引起微弱Tm变化，说明绝大多数化合物不直接结合MBNL1蛋白。
     • 核磁共振（NMR）波谱学： 通过观察化合物对含有两个1×1 UU内部环的模型RNA的亚氨基质子谱的影响，进一步证实了化合物的结合位点。大多数化合物（A1-A6, B3, B4）引起内部环区域质子峰的化学位移改变或展宽，而B1和B2作用较弱。这表明活性化合物主要结合在r(CUG)exp形成的特征性内部环结构上。

第四阶段：在DM1疾病模型中验证小分子功能

1. 细胞模型： 使用DM1患者来源的成纤维细胞（携带~1300个CUG重复）和野生型对照细胞。通过诱导表达MyoD1，将成纤维细胞强制分化为肌管（myotube），该模型能重现DM1的关键病理特征。

2. 表型挽救实验：

   • 剪接缺陷挽救： 在分化过程中用化合物处理DM1肌管，通过RT-PCR分析MBNL1自身外显子5的异常剪接（在DM1中错误包含）。10个命中物中的6个（A2, A4, A6, B1, B2, B3）在50 μM浓度下能显著挽救剪接缺陷，其中A6效果最强，使外显子包含率从31%降至14%（接近野生型5%的水平）。A6的剂量反应IC50约为15 μM。这些活性化合物对野生型肌管的剪接无影响，且对另一个由NOVA蛋白调控的剪接事件（MAP4K4外显子22a）也无作用，表明了其作用特异性。
   • 核内病灶减少： 通过smFISH（靶向DMPK编码区）和IFA（抗MBNL1抗体）对DM1肌管进行成像。结果显示，A4、A6、B2和B3能显著减少含有r(CUG)exp和MBNL1的核内病灶的数量和强度，从形态学上直接证明了这些化合物能在疾病相关细胞中破坏毒性RNA-蛋白质复合物。
   • 机制排除： 通过RT-qPCR检测，排除了部分化合物（A4, A6, B2, B3）通过下调DMPK或MyoD转录本（影响分化）来发挥作用的可能性，支持其直接靶向RNA的作用机制。而A2和B1则显示出一定的转录抑制效应。
   • 结合亲和力测定： 通过荧光滴定实验测得A6与模型r(CUG)2 RNA的解离常数（Kd）为17 ± 2 μM，且对完全配对的对照RNA无结合，证实了其特异性和中等亲和力。

四、 主要研究结果及其逻辑关联 1. 成功开发了活细胞NanoBRET检测平台： 研究结果第一部分证实，针对r(CUG)exp-MBNL1相互作用的NanoBRET检测方法具有高特异性、可重复性，并与RNA丰度及细胞表型（病灶形成）变化直接相关。Z’因子达标，验证了其适用于HTS。该结果为后续的小分子筛选奠定了坚实的技术基础。 2. 筛选并鉴定出具有共同化学型的活性小分子： 利用上述平台，从72个化合物的聚焦库中筛选出10个能破坏目标RPI的命中物，并归纳为A、B两个化学型家族。体外TR-FRET和DSF/NMR实验证明，这些分子主要通过直接结合r(CUG)exp RNA的UU内部环发挥作用，而非结合MBNL1蛋白。这证明了NanoBRET平台用于发现靶向致病性RNA结构的小分子的可行性。 3. 小分子在患者来源疾病模型中展现治疗潜力： 关键性结果表明，部分命中物（尤其是A6）不仅能在报告细胞系中破坏相互作用，更能在于DM1患者来源的肌管模型中，剂量依赖性地挽救核心的剪接缺陷并减少致病性核内病灶，且作用机制与直接靶向RNA一致。这建立了从体外结合、细胞水平相互作用抑制到疾病相关功能表型挽救的完整证据链，将“命中物”提升为具有潜在治疗价值的“先导化合物”。 4. 揭示了细胞与体外实验结果的异同： 研究指出，部分化合物（如A1、B1）在体外结合/TR-FRET检测与细胞NanoBRET或功能表型检测中的效力排名不完全一致，提示了细胞通透性、亚细胞定位、脱靶效应等因素在活细胞环境中的重要性。这强调了在生理相关系统中进行筛选和验证的必要性，这也是本研究所开发平台的核心价值所在。

五、 研究结论与价值 * 结论： 本研究成功开发并验证了一种基于NanoBRET的通用型活细胞检测平台，用于实时监测RNA-蛋白质相互作用。将该平台应用于DM1模型，实现了对致病性r(CUG)exp-MBNL1相互作用的定量检测和高通量筛选。通过筛选，发现了一系列可直接结合CUG重复内部环结构、并在患者来源细胞中有效挽救疾病相关剪接缺陷和减少核内病灶的小分子化合物。 * 科学价值： 1. 方法学创新： 提供了一种在天然细胞环境下研究动态RPIs的强大新工具，克服了传统体外方法的局限性。 2. 药物发现新策略验证： 证实了针对结构化重复RNA进行小分子药物发现的可行性，为治疗DM1及其他由毒性RNA增益功能（toxic RNA gain-of-function）引起的疾病（如其他微卫星重复疾病）提供了新的潜在治疗途径。 3. 机制深入理解： 通过多层次的验证（BRET、成像、剪接分析、结合研究），为小分子调节特定RPI并最终影响下游病理表型的机制提供了清晰范例。 * 应用价值： 所开发的NanoBRET平台可扩展至研究其他疾病相关的RPIs（如其他RNA重复扩展疾病、癌症中异常的非编码RNA-蛋白互作），加速针对“不可成药”RNA靶点的小分子疗法的发现进程。鉴定的先导化合物（如A6）为开发DM1的治疗药物提供了起点。

六、 研究亮点 1. 创新性的技术平台： 首次将NanoBRET技术系统性地应用于活细胞内RNA-蛋白质相互作用的监测与抑制剂筛选，建立了标准化、可高通量化的操作流程。 2. 从技术开发到疾病治疗的完整闭环： 研究不仅停留在方法建立，更将其实际应用于特定疾病的药物发现，并最终在患者来源的疾病相关细胞模型中验证了先导化合物的功能疗效，完成了从概念到潜在应用的完整转化研究链条。 3. 多学科交叉与多层次验证： 整合了细胞生物学、化学生物学、生物物理学（NMR）和分子生物学技术，对筛选结果进行了从分子结合、细胞互作到功能表型的多层次、正交性验证，结论坚实可靠。 4. 聚焦于具有明确临床病理关联的靶点： 选择DM1这一由明确RNA-蛋白质相互作用机制驱动的疾病作为模型，使得研究发现具有直接的转化医学意义。

七、 其他有价值的要点 * 研究探讨了在MBNL1融合蛋白中添加核定位信号（NLS）对检测性能的影响，发现无显著改善，说明原始构建体中存在于细胞质的部分对背景信号贡献很小，这简化了未来的应用设计。 * 作者展望了该平台的普适性，提出可通过将Halotag配体结合型RNA适配子（aptamer）融合到目标RNA上，理论上可将此NanoBRET策略拓展至研究任何感兴趣的RNA与带有Nanoluc标签的蛋白质之间的相互作用，极大地扩展了平台的适用范围。 * 研究还指出，该检测对RNA丰度变化敏感，因此也兼容于那些通过降解靶RNA（如核酶招募剂）来发挥作用的新型治疗模式的高通量筛选。