本文发表于期刊 Clinica Chimica Acta 2023年第548卷，文章在线发表日期为2023年8月3日。本研究的作者团队来自荷兰阿姆斯特丹大学医学中心（Amsterdam UMC），包括Heleen I. Jansen, Héloïse G. Gohy, Anita Boelen, Peter H. Bisschop, Jacquelien J. Hillebrand，以及通讯作者Annemieke C. Heijboer。所有作者均隶属于该中心的实验室医学部、内分泌代谢科以及相关研究机构。
本研究的学术背景聚焦于内分泌学与临床检验医学领域，具体涉及格雷夫斯病（Graves‘ disease， GD）的诊断。格雷夫斯病是一种由促甲状腺激素受体抗体（TSH-receptor antibodies， TRAbs）引起的自身免疫性甲状腺功能亢进症。在临床诊断中，检测TRAbs浓度对于区分GD与其他原因引起的甲亢至关重要。目前，市场上存在多种用于检测TRAbs的免疫测定法，但这些方法缺乏标准化，其判定阳性/阴性的截断值（cut-off value）也各不相同。其中，Kryptor（赛默飞世尔）和Cobas（罗氏）检测法是已确立并广泛使用的第三代免疫测定法，具有良好的诊断性能。近期，雅培公司推出了新的Alinity TRAbs免疫测定法，但其性能数据有限，仅有一项近期研究对其进行了评估。因此，本研究的主要目的是评估新近应用的Alinity TRAbs免疫测定法的性能，并将其与已确立的Kryptor和Cobas免疫测定法进行比较。此外，由于缺乏长期储存稳定性的数据，本研究还旨在评估血清样本在-20°C下储存多年以及经历多次冻融循环对TRAbs浓度稳定性的影响。
研究的详细工作流程包含两个主要部分：TRAbs浓度稳定性评估与三种免疫测定法的性能比较。
在第一部分（稳定性评估）中，研究者使用了既往检测剩余的血清样本。首先，他们评估了长期储存稳定性。从库存中选取了54份血清样本，这些样本此前已使用Kryptor法检测过TRAbs浓度（初始浓度T0），并已在-20°C下储存了不同年限：4年（n=16）、5年（n=15）和6年（n=23）。随后，使用相同的Kryptor免疫测定法对这些储存后的样本进行了重复检测，比较储存前后（T4、T5、T6与T0）的浓度差异。其次，他们评估了冻融循环的影响。选取了另外20份血清样本，在室温下解冻后立即使用Kryptor法测量TRAbs浓度，然后再次冷冻至-20°C。此过程重复五次，模拟最多五次冻融循环，并计算每次循环后浓度的百分比变化。在数据处理上，使用Wilcoxon符号秩检验来评估长期储存前后浓度的统计学差异，并通过计算百分比变化范围来评估冻融稳定性。
在第二部分（方法学比较）中，研究样本来源于2016年12月至2019年1月期间在阿姆斯特丹UMC门诊就诊、并已使用Kryptor法检测过TRAbs的患者剩余血清，共计436份。所有样本在采集后均储存在-20°C。在2021年12月，研究者使用Alinity免疫测定法和Cobas免疫测定法对这436份样本（或其子集）进行了重复测量。由于技术问题，有9份样本未能在Alinity上检测，9份未能在Cobas上检测，因此最终用于配对比较的样本量为：Kryptor vs Alinity （n=434）， Kryptor vs Cobas （n=427）， Cobas vs Alinity （n=425）。本研究没有开发新的实验方法或设备，而是严格遵循各制造商（Kryptor、Cobas、Alinity）的说明书进行操作。所使用的关键商业化免疫测定法技术细节如下：Kryptor法采用时间分辨放大穴状化合物发射（TRACE）技术的竞争性两步法免疫测定，使用鼠源性单克隆抗体m22a；Cobas法为电化学发光免疫测定法（ECLIA），使用人源性单克隆抗体m22；Alinity法为延迟一步法化学发光微粒子免疫检测法（CMIA），同样使用人源性单克隆抗体m22。三者均为第三代检测法，但校准标准不同（Kryptor和Cobas使用第一代WHO国际标准90/672，Alinity使用第二代WHO标准08/204）。判定阳性/阴性时，分别采用了制造商推荐的截断值：Kryptor > 1.80 U/L， Cobas > 1.75 U/L， Alinity > 3.10 U/L。数据统计分析方面，首先根据截断值将结果分类为阳性或阴性，通过交叉表计算不同方法间的一致性和差异百分比。使用Kappa系数评估方法间的一致性程度（<0.20为轻微，0.21-0.40为一般，0.41-0.60为中等，0.61-0.80为高度，>0.80为几乎完全一致）。此外，还使用Passing-Bablok回归分析比较了不同方法间绝对浓度值的关系。
研究的主要结果如下：
在稳定性方面，长期储存评估显示，储存4年和5年的样本，其TRAbs浓度与初始浓度相比无统计学显著差异（Wilcoxon检验p值分别为0.84和0.09）。然而，储存6年的样本显示出虽小但具有统计学意义的浓度升高（中位数增加2.0 U/L， p=0.006）。尽管如此，这种差异在临床意义上可能有限，因为只有一个接近截断值（1.7 U/L）的样本从阴性转为阳性（2.2 U/L），而其他阴性结果保持阴性，阳性结果保持阳性。因此，研究者得出结论：TRAbs浓度在-20°C下储存长达5年是稳定的，储存超过6年则需谨慎对待。在冻融循环评估中，经过最多五次冻融循环后，TRAbs浓度的百分比变化范围在-4.22%到1.03%之间（考虑内部对照的变异），表明TRAbs浓度可耐受多达五次冻融循环而不发生显著变化。
在方法学比较方面，三种方法在相同样本集中报告的阳性率不同：Cobas法最高（65.3%），其次是Alinity法（59.4%），Kryptor法最低（52.1%）。方法间的一致性分析显示，Alinity与Cobas法之间的一致性最高，总差异率最低（5.4%），Kappa系数为0.885（几乎完全一致）。Alinity与Kryptor之间的总差异率为8.8%，Kappa系数为0.824（几乎完全一致）。Cobas与Kryptor之间的总差异率最高（13.3%），Kappa系数为0.728（高度一致）。具体来看，不一致的结果呈现特定模式：Kryptor法比其他两种方法更倾向于报告阴性结果。当Kryptor结果为阴性时，Cobas和Alinity报告为阳性的情况分别占12.9%和8.1%；而相反情况（Kryptor阳性，其他阴性）则非常少见（0.5%和0.7%）。在Cobas与Alinity的比较中，Cobas报告阳性而Alinity报告阴性的情况占5.2%，反向情况仅占0.2%。在全部样本中，有60份（13.8%）的结果在三种方法间存在不一致。对这些不一致样本的患者病历回顾发现，其中相当一部分患者正在接受GD治疗，其TRAbs浓度处于下降过程中。
本研究的主要结论是：首先，血清中的TRAbs浓度在-20°C下储存至少5年以及经历多达5次冻融循环是稳定的，这为基于长期储存样本的回顾性研究提供了重要依据。其次，新近应用的Alinity TRAbs免疫测定法与已广泛使用的Kryptor和Cobas测定法总体一致性良好。具体表现为，Alinity与Cobas法的一致性最佳，与Kryptor法的一致性也较高。尽管存在差异，即Alinity比Kryptor报告了更多阳性结果，而比Cobas报告了更多阴性结果，但这些差异在可接受的范围内。研究指出，Kryptor法使用的较高截断值（1.80 U/L）以及其“不确定区间”（1.0-1.80 U/L，本研究中按阴性处理）可能是导致其阳性率较低的原因之一。特别是，在56份Kryptor阴性而其他方法阳性的不一致样本中，有21份（37.5%）的Kryptor结果恰好处于这个“不确定区间”。这表明，对于处于治疗中、TRAbs浓度下降的患者，Cobas和Alinity法可能具有更高的检测灵敏度。
本研究的价值和意义体现在以下几个方面：在科学价值上，首次系统评估了TRAbs在长期储存（长达6年）和多次冻融下的稳定性，填补了该领域的知识空白。在临床应用价值上，对新上市的Alinity TRAbs检测法进行了全面的性能验证，为其在临床实验室的推广应用提供了关键数据支持。研究结果提示临床医生和实验室人员，在解读不同检测方法的TRAbs结果、特别是在结果接近截断值或患者处于治疗随访期时，需注意方法间可能存在的差异，并结合临床背景进行综合判断。研究也强调了未来需要进一步研究以确定各免疫测定法在诊断GD时的最佳截断值，这有助于提高不同检测平台结果的可比性和诊断准确性。
本研究的亮点在于：第一，研究设计全面，同时评估了分析前（样本稳定性）和分析中（方法学比较）两个关键环节。第二，样本量较大（n>400），且来源于真实的临床患者，增强了结果的代表性和外推性。第三，对不一致结果进行了深入分析（如回顾患者病历、关注“不确定区间”样本），为观察到的差异提供了合理的临床解释。第四，首次将新的Alinity测定法与两种主流的、性能已知的测定法（Kryptor和Cobas）进行三方比较，提供了更全面的性能视角。
其他有价值的内容包括：研究详细说明了三种免疫测定法所使用的不同技术平台（TRACE， ECLIA， CMIA）、抗体来源（鼠源性vs人源性）和校准标准（不同WHO标准），这些技术细节的差异是导致结果不一致的潜在原因。作者在讨论中指出，由于本研究是实验室质量改进项目，未能获取患者的年龄、性别、最终诊断等完整临床信息，因此无法计算各方法的诊断敏感性和特异性，也无法确定最优截断值，这是本研究的一个局限性，也为未来研究指明了方向。文章最后建议，针对所有TRAbs免疫测定法（包括Alinity）进行诊断敏感性、特异性及最佳截断值的研究，将有助于进一步提升GD的诊断水平和不同检测方法间的可比性。