本研究由中国医科大学附属第四医院眼科、中国医科大学眼科医院、辽宁省重点晶状体研究实验室的Dong-Yue Ma、Jin-Xia Liu等团队完成，通讯作者为Qin Yu教授。研究成果于2023年5月6日在线发表于《Free Radical Biology and Medicine》期刊第204卷，文章标题为”GSK-3β-dependent Nrf2 antioxidant response modulates ferroptosis of lens epithelial cells in age-related cataract”。
本研究聚焦于年龄相关性白内障（age-related cataract, ARC）的发病机制研究。作为全球视力障碍的首要原因，ARC目前主要依赖手术治疗，但存在费用高昂和术后并发症等问题。氧化应激诱导的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells, LECs）死亡是ARC发病的核心环节，其中铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性程序性细胞死亡方式，因脂质过氧化物积累和活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生而日益受到关注。
研究团队前期发现，在衰老晶状体中存在Fe2+积累现象，这使晶状体更易发生氧化应激诱导的铁死亡。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythrocyte 2 related factor 2, Nrf2）作为抗氧化系统的核心转录因子，已被证实与脂质过氧化和铁死亡密切相关。然而，GSK-3β（glycogen synthase kinase-3β）如何通过β-转导重复包含蛋白（β-transducin repeat-containing protein, β-TrCP）调控Nrf2蛋白降解，进而影响LECs铁死亡的具体机制尚不明确。因此，本研究旨在阐明GSK-3β/Nrf2轴在LECs铁死亡中的调控作用，为ARC的非手术治疗提供新靶点。
本研究采用多层面实验设计，包含临床样本分析、动物模型构建和细胞实验三个主要部分，共涉及以下关键实验流程：
1. 临床样本分析 收集了2021年4月至2022年3月期间中国医科大学附属第四医院眼科的白内障患者晶状体前囊上皮样本（n=3/组），根据最佳矫正视力和裂隙灯检查分为轻度ARC和重度ARC两组。采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察线粒体形态变化，Western blot和免疫荧光检测铁死亡标志物（GPX4、TFR1、FTH1、SLC40A1）表达。
2. 动物实验 使用8周龄和24月龄C57BL/6J雌性小鼠（n=3/组）比较自然衰老过程中的变化。通过尾静脉注射碘酸钠（sodium iodate, NaIO3，50 mg/kg）构建氧化应激诱导的白内障模型，其中一组小鼠在每次NaIO3注射前3天腹腔注射GSK-3β抑制剂SB216763（10 mg/kg）。采用立体显微镜观察晶状体混浊程度，H&E染色评估细胞形态，Lillie染色检测Fe2+积累，TEM观察线粒体变化。
3. 细胞实验 使用人晶状体上皮细胞系HLE-B3，设立以下处理组： - NaIO3（2.5 mM，24 h）和erastin（7.5 μM，24 h）诱导铁死亡 - 铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1，60 μM） - Nrf2 siRNA转染（si-Nrf2-2） - Nrf2激活剂tert-butylhydroquinone（tBHQ，10 μM）预处理 - GSK-3β抑制剂SB216763（10 μM）预处理
实验方法包括：CCK-8检测细胞活力，DCFH-DA和DHE荧光探针检测ROS水平，BDP 581⁄591 C11检测脂质过氧化，FerroOrange检测Fe2+含量，ELISA测定GSH水平，qPCR和Western blot分析基因和蛋白表达。
创新性方法：本研究首次在ARC模型中系统验证了铁死亡的存在，并建立了GSK-3β/Nrf2/铁死亡轴的调控网络。特别开发了NaIO3诱导的氧化应激白内障模型与时间梯度给药方案，为后续机制研究提供了可靠平台。
1. ARC患者和衰老小鼠LECs中存在铁死亡 TEM显示随着ARC程度加重，LECs线粒体体积缩小、数量减少、膜密度增加（图1d）。Western blot结果显示重度ARC患者中TFR1和FTH1表达上调，SLC40A1和GPX4下调（图1e-f）。24月龄小鼠表现出相似变化（图2），证实铁死亡是ARC的重要病理特征。
2. NaIO3诱导的氧化应激模型中铁死亡是主要细胞死亡形式 NaIO3处理导致小鼠晶状体混浊（图3b），LECs排列紊乱（图3c），Fe2+积累增加（图3d）。在HLE-B3细胞中，NaIO3和erastin处理使细胞活力下降约50%，Fer-1可显著挽救这种损伤（图4e），而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死性凋亡抑制剂Nec-1s效果有限，证实铁死亡是主要死亡方式。
3. Nrf2对LECs铁死亡具有关键调控作用 Nrf2敲除小鼠对NaIO3诱导的铁死亡更敏感，表现为更显著的Fe2+积累（图5f）和铁死亡标志物改变（图5g-j）。在细胞水平，si-Nrf2加剧NaIO3诱导的ROS、脂质过氧化物和Fe2+积累（图6d-g），而tBHQ预处理可逆转这些效应（图6j-p）。
4. GSK-3β通过非Keap1依赖途径调控Nrf2降解 在ARC患者、衰老小鼠和NaIO3模型中，Nrf2蛋白水平降低但Keap1表达同步下降（图7），提示存在Keap1非依赖的降解途径。GSK-3β和β-TrCP在衰老和氧化应激模型中表达上调（图8a-b），免疫荧光证实GSK-3β与ARC严重程度正相关（图8c-h）。
5. 抑制GSK-3β可减轻LECs铁死亡 SB216763预处理显著降低NaIO3诱导的Fe2+积累（图9a）、ROS和脂质过氧化（图9b-e），逆转铁死亡标志物变化（图9f-i）。免疫荧光显示SB216763促进Nrf2核转位（图9j-l）。在动物实验中，SB216763减轻LECs丢失（图10a）和Fe2+积累（图10b），改善Nrf2及其下游靶点表达（图10c-h）。
本研究系统阐明了GSK-3β/Nrf2轴在ARC发病中的核心作用：氧化应激通过上调GSK-3β，促进β-TrCP介导的Nrf2蛋白降解，削弱细胞抗氧化能力，导致铁死亡关键蛋白（GPX4、SLC7A11、TFR1等）表达紊乱，最终引发LECs铁死亡和晶状体混浊。研究首次证实靶向GSK-3β可通过稳定Nrf2抑制LECs铁死亡，为ARC的药物防治提供了新策略。
本研究不仅为ARC治疗提供新思路，其发现的铁死亡调控机制也可能适用于其他年龄相关眼病（如年龄相关性黄斑变性）。此外，建立的实验体系可用于筛选其他抗白内障候选药物。团队计划进一步探索SB216763在糖尿病性白内障等疾病中的应用潜力，并开发靶向GSK-3β/Nrf2相互作用界面的特异性药物。