AlphaFold3在抗体-抗原及纳米抗体-抗原对接中的突破与局限：一项系统性评估研究

作者及机构
本研究由约翰霍普金斯大学（Johns Hopkins University）化学与生物分子工程系的Fatima N. Hitawala和Jeffrey J. Gray*（通讯作者，邮箱：jgray@jhu.edu）合作完成，预印本发布于bioRxiv（2025年1月29日），DOI: 10.¹¹⁰¹⁄₂₀₂₄.09.21.614257。

学术背景
抗体药物开发是生物医学领域的核心方向，但传统实验方法耗时耗力，计算设计成为加速研发的关键。AlphaFold系列模型在蛋白质结构预测中表现卓越，但其前代版本（如AlphaFold2-multimer, AF2-m）在抗体-抗原对接任务中成功率仅20%，主要受限于互补决定区（Complementarity Determining Region, CDR）尤其是CDR H3环的构象灵活性。本研究旨在系统评估AlphaFold3（AF3）在抗体/纳米抗体（nanobody）结构预测及抗原对接中的性能，揭示其改进机制与现存缺陷，为抗体工程提供优化方向。

研究流程与方法
1. 数据集构建
- 数据来源：从SAbDab数据库（截至2024年5月31日）筛选118个抗体-抗原复合物和70个纳米抗体-抗原复合物，确保与AF3训练集（截止2021年9月30日）无时间重叠。
- 质量控制：剔除分辨率≥2.8 Å或CDR环残基缺失的结构，通过Kabsch算法去除冗余（重链/轻链RMSD>1 Å），最终保留非冗余且序列同源性<95%的样本。

1. 模型对比与评估

   • 测试模型：AF3（单种子采样）、AF2.3-m、AlphaRed（混合AF2与Rosetta的算法）及IgFold。
     
   • 评估指标：
     
     • 对接质量：DockQ分数（CAPRI标准：>0.23为“可接受”，>0.8为“高精度”）。
       
     • 结构准确性：CDR H3环的全局/局部RMSD（均方根偏差），区分抗原结合（bound）与非结合（unbound）状态下的构象差异。
       
   • 实验设计：每个靶标运行3次随机种子，每次生成5个扩散样本（diffusion decoys），选取排名最高的构象进行分析。
     

2. 创新性分析方法

   • 条件概率分析：量化CDR H3精度与对接成功的相互依赖性，例如计算P(DockQ≥0.8 | CDR H3 RMSD≤1.5 Å)。
     
   • 多尺度置信度整合：结合AF3输出的界面预测局部距离差异测试（i-plddt）、重链-抗原界面TM分数（iptm-ha）与Rosetta结合能（δGB），通过受试者工作特征曲线（AUROC）优化筛选阈值。
     

主要结果
1. 对接性能突破
- AF3单种子采样的高精度（DockQ≥0.8）成功率：抗体11.0%、纳米抗体11.4%，显著高于AF2-m（接近0%）和AlphaRed（43%）。
- 典型案例：图1展示AF3成功预测抗体CDR H3环与抗原表位的精确相互作用，而失败案例多因抗原界面采样错误（图1-补充1）。

1. CDR H3与对接的协同优化

   • 关键发现：高精度对接（DockQ≥0.8）中96.9%的抗体和99%的纳米抗体CDR H3 RMSD≤1.5 Å，反之则概率骤降（27.8%），表明CDR H3准确性是成功对接的必要条件。
     
   • 抗原上下文效应：抗原序列输入使抗体CDR H3全局RMSD从2.73 Å提升至2.05 Å（p=0.02），尤其对长环（>15残基）改善显著（5.89 Å→3.64 Å，p=4.12×10⁻⁸）。
     

2. 未结合抗体结构预测

   • AF3预测未结合抗体CDR H3的中位RMSD为2.15 Å，优于AF2.3-m（2.73 Å）和IgFold（2.87 Å），但仍高于实验测得的结合-未结合构象差异中位数（0.5 Å），提示进一步优化空间。
     

3. 置信度指标优化

   • 最佳组合：
     
     • 抗体：i-plddt≥85联合δGB≤-65 REU（Rosetta能量单位），n-AUC=0.985。
       
     • 纳米抗体：δGB≤0 REU联合i-plddt≥73，n-AUC=0.992。
       
   • 局限性：AF3生成的构象可能存在空间冲突，Rosetta快速松弛（fastrelax）未能显著改善筛选效果。
     

结论与价值
1. 科学意义
- AF3通过扩散模型（diffusion model）的多尺度特性，实现了抗体-抗原复合物的协同建模，其CDR H3预测精度的提升直接推动对接成功率。
- 揭示了抗原上下文对CDR H3构象约束的机制，为柔性环区的计算设计提供新思路。

1. 应用价值
   
   • 为抗体药物开发提供高效工具：单种子采样即可实现11%的高精度对接，结合多种子采样（如1000次）可进一步提升至60%。
     
   • 公开的基准数据集（Zenodo: 14722282）与代码库（GitHub: noorifatima/af3_abnb_benchmark）助力后续方法开发。
     

研究亮点
1. 方法学创新：首次系统性评估AF3在抗体/纳米抗体对接中的性能，提出基于条件概率的构效关系分析框架。
2. 技术突破：联合i-plddt与δGB的筛选策略，将高精度复合物的识别效率提升至98.5%。
3. 领域启示：AF3的60%失败率（单种子）表明，抗体设计仍需优化采样多样性或引入物理力场修正。

其他发现
- 纳米抗体特殊性：其单链特性使CDR H3精度更依赖对接成功（64.7%高精度对接的CDR H3 RMSD≤1 Å，而抗体为38%）。
- 数据局限性：受限于AF3服务器的计算配额，大规模种子采样的全面评估需依赖本地部署。

（注：全文基于预印本内容，正式发表时数据或微调。）