主要作者： Ramon D. van Valderen, Brenda E. Juarez-Garza, Stijn de Smit, Marcel Ottens, Cees Haringa
研究机构： Delft University of Technology（代尔夫特理工大学）
发表期刊： Biochemical Engineering Journal 第236卷，文章编号110365，2026年发表
人类干细胞在再生医学领域具有巨大潜力，可应用于细胞治疗、组织工程及生物人工器官构建。然而，要生产临床所需数量的干细胞，必须借助可控且可放大的培养系统，搅拌罐生物反应器因其良好的可放大性和对pH、温度、溶解氧等关键工艺参数的精确控制能力而成为优选平台。近年来，微载体（microcarrier）技术的发展使得干细胞能够以悬浮培养形式在搅拌罐生物反应器中扩增和分化，间充质干细胞（MSCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）均已成功在微载体上实现生物反应器培养。
然而，搅拌罐生物反应器中存在一个核心矛盾：搅拌产生的水动力应力（hydrodynamic stress）可能损伤剪切敏感型干细胞，但同时又必须保证微载体或细胞聚集体充分悬浮、维持足够的氧传递和营养混合。深入理解并调控生物反应器内部的局部水动力条件，对于维持细胞活力、防止聚集体内部坏死核心的形成以及确保微载体完全悬浮至关重要。
计算流体力学（CFD）已成为生物过程工程中表征反应器的重要工具，但传统的单相CFD和欧拉-欧拉（Eulerian–Eulerian）多相方法均无法对单个微载体进行追踪，因而无法从微载体视角（即“生命线”/lifeline视角）评估其所经历的水动力应力暴露。此外，许多干细胞培养仅依赖液面上方空间（headspace）通气进行溶解氧控制，以避免气泡破裂产生的剪切损伤，但工业规模（200–2000 L）下该方法可能不再可行，因此需量化自由表面体积氧传质系数（kLa）等关键放大参数。
本研究旨在建立一个综合性的欧拉-拉格朗日（Eulerian–Lagrangian）CFD–DEM模型，对250 ml生物反应器中的微载体培养进行一体化表征，同时量化反应器放大参数、微载体悬浮状态和微载体所承受的水动力应力。研究目标包括：验证模型在功率输入、混合时间、自由表面kLa及微载体悬浮转速等方面的预测精度；考察搅拌转速、桨叶泵送模式、桨叶高度和装液量对反应器性能的影响；并利用微载体生命线数据直接量化水动力应力。
1. 反应器配置与几何建模
研究使用Applikon MiniBio 250 ml生物反应器（Getinge, Delft, Netherlands），采用典型的哺乳动物细胞培养配置，包含一个或两个45°斜叶象耳桨（elephant ear impeller）。反应器配备温度传感器、溶解氧传感器、pH传感器、开孔分布器（sparger）和两根取样管。反应器主要尺寸为：罐径T = 0.06 m，桨径D = 0.028 m，罐高H = 0.115 m，离底间隙C = 0.016–0.026 m，桨间距S = 0.028–0.042 m。
2. 流体流动模拟
采用M-Star CFD软件v3.13.124进行两相流体模拟，该软件使用格子玻尔兹曼（Lattice-Boltzmann, LB）方法求解不可压缩Navier–Stokes方程。自由表面动力学采用基于Allen–Cahn方程的保守相场格子玻尔兹曼方法建模，气体动力学被简化处理为在气液界面上施加恒定压力（1 atm）。湍流采用大涡模拟（LES）配合Smagorinsky–Lilly闭合模型，Smagorinsky系数设为0.1。桨叶-流体相互作用采用浸没边界法（immersed boundary method）建模。桨叶功率数Po通过扭矩积分计算，雷诺数Reimp在过渡流和完全湍流范围内进行评估。
3. 混合时间模拟
数值混合研究采用标量输运模型，描述被动标量通过流体的对流-扩散过程。为与实验pH示踪法保持一致，在pH探针下方设置5×10×5格子点的监测区域。示踪剂在流体动能达到拟稳态后脉冲注入液面以下，共注入六次，间隔2秒，以量化大涡模拟中混合时间的不确定性。示踪剂的扩散系数设为9.3×10⁻⁹ m²/s（与水中的H⁺一致）。
4. 自由表面kLa模型
自由表面kLa由计算得到的自由表面界面面积A和自由表面速度Vf推导得出。液侧传质系数kL通过无量纲关联式（kLL/Dm）= C(VfL/ν)^a(ν/Dm)^b计算，其中a=4/5、b=1/3、C=0.21，特征长度L取反应器直径。氧在水中的扩散系数在37°C下取2.56×10⁻⁹ m²/s。
5. 颗粒模型（DEM）
微载体通过离散元方法（DEM）作为单个颗粒建模。颗粒运动方程包含重力、浮力、拖曳力和虚拟质量力。拖曳系数采用Brown和Lawler的解析表达式，适用于颗粒雷诺数Rep < 10⁵。颗粒-颗粒接触力采用软球接触模型，法向力使用赫兹模型，切向力使用Mindlin模型。颗粒对流体的反向耦合（双向耦合）采用简化密度方法，仅考虑重力和浮力的净效应。DEM时间步长约为流体时间步长的1/20，使用标准D3Q19速度离散格式，在NVIDIA RTX3090 24GB GPU上进行模拟。模拟中使用的微载体参数基于Cytodex-1（密度1030 kg/m³，粒径150–180 μm），浓度为0.5 g/L，对应颗粒数约40万–60万；悬浮实验验证使用的Cosmopheric聚乙烯颗粒（密度1030 kg/m³，粒径180–212 μm）共33000个。
6. 拉格朗日指标定义
从微载体生命线直接获取能量耗散率（ε）分布，并计算Kolmogorov长度尺度λk = (ν³/ε)^(1⁄4)。累积水动力损伤（AHD）通过积分ε时间序列获得。悬浮判定采用拉格朗日方法：若颗粒高度低于6.2 mm且位于壁面最内层流体体素内或与已判定为底部的颗粒重叠，则认为其位于反应器底部；若颗粒在底部停留少于2秒则视为悬浮。微载体分散程度通过平均最近邻距离rnn评估。
7. 实验验证
混合时间实验采用pH示踪法，使用Applisens pH探针测量，探针响应时间（t_probe,90）测得为55.0±20.4秒，需采用Zhang等人提出的探针滞后校正方法进行信号去卷积。自由表面kLa实验采用gassing out法，在37°C下用自来水作为介质，使用Lumisens光学溶解氧传感器测量。颗粒悬浮实验使用Cosmopheric聚乙烯颗粒（33000个，0.17 g），在160 ml去离子水中进行，加入20 μl Tween20表面活性剂，拍摄反应器底部图像并通过图像分割定量未悬浮颗粒床尺寸。
1. 模型验证结果
预测的功率数在过渡流和完全湍流范围内与Zhu等人和Delbridge等人的实验数据吻合良好，在完全湍流区（Reimp > 2×10⁴）功率数收敛至1.90±0.01，与文献中2.12±0.26和2.13±0.01一致。模拟混合时间与实验测量值在全部转速范围内吻合，平均绝对误差为1.4 s（相对误差16.3%），远优于van’t Riet和van der Lans经验关联式的预测（平均绝对误差3.4 s，相对误差39%）。自由表面kLa在除540 rpm/80 ml（该工况出现涡旋气泡卷入）外的所有操作条件下均与实验值吻合良好，平均绝对误差为0.18 h⁻¹（相对误差13.1%）。颗粒悬浮实验验证显示，在下泵送模式（down-pumping）下模拟与实验的沉淀床尺寸在所有转速下均吻合；但在上泵送模式（up-pumping）下转速低于60 rpm时模拟预测的沉淀床明显偏小，这归因于模拟中缺乏颗粒疏水性相互作用和润滑力等物理机制，导致颗粒在反应器底部的聚集行为被低估。基于严格的Zwietering 2秒准则，实验确定的Njs约为110 rpm（两种泵送模式均如此）。
2. 搅拌转速与泵送模式的影响
上泵送模式的平均功率数为2.7，高于下泵送模式的2.0，这主要由于反应器内部构件和碟形底部的几何效应。上泵送模式的单位体积功率输入P/V比下泵送高出约35%。上泵送模式的混合时间比下泵送低1.5–3倍，自由表面kLa也高出最多1.5倍。然而，下泵送模式的微载体悬浮百分比较上泵送高5个百分点。在90 rpm工况下，下泵送模式中20.4%的水动力条件下Kolmogorov涡小于微载体中位粒径的2/3（即Croughan等人提出的潜在损伤阈值），而上泵送模式为26.5%。累积水动力损伤（AHD）曲线显示上泵送模式下损伤随时间的增长速度更快。综合悬浮效率和应力水平，90 rpm下泵送被确定为优先操作模式。
3. 桨叶高度的影响
将桨叶高度从C/H = 0.14增加至0.22时，悬浮微载体百分比下降了5个百分点，自由表面kLa从0.45 h⁻¹增至0.51 h⁻¹，混合时间t95从44.6 s急剧下降至21.1 s。功率数从1.96增至2.27。桨叶高度对水动力应力的影响不显著：平均λk从244 μm（C/H=0.14）降至211 μm（C/H=0.22），但最小λk保持在约25.3–26.5 μm。低于损伤阈值的条件比例从16.1%（C/H=0.22）增至19.4%（C/H=0.14），AHD也随桨叶高度降低而略微增加，但这主要是由于更多微载体处于悬浮状态所致。
4. 装液量的影响
在VL = 200 ml时，t95在240 s后仍未达到，表明反应器顶部混合极差；而VL = 140 ml时t95为36 s，VL = 80 ml时为8 s。微载体的平均最近邻距离rnn从412 μm（VL=80 ml）降至405 μm（VL=140 ml）和369 μm（VL=200 ml），表明微载体在高装液量下无法充分分散至整个反应器。自由表面kLa从1.40 h⁻¹（VL=80 ml）降至0.55 h⁻¹（VL=140 ml）和0.34 h⁻¹（VL=200 ml），氧传递速率下降4.1倍，远超仅由界面面积减少所预期的2.5倍。在VL=80 ml时，λk分布变得更为均匀，双峰特征消失；而VL=140 ml和200 ml时λk分布呈双峰，这是由反应器顶部循环较慢导致的。从VL=140 ml增至200 ml时水动力应力无显著变化，因为微载体未能分散至新增的流体区域。研究建议在单桨下泵送、C/H=0.14、90 rpm条件下最大可操作工作体积约为140 ml；若需更高装液量应采用双桨配置，且桨间距S/D=1.5时两个桨叶水动力上相互独立，性能最优。
本研究成功开发并验证了250 ml搅拌罐生物反应器中微载体培养的CFD–DEM模型，该模型能在20%精度范围内预测功率输入、混合时间和自由表面kLa，并能在宽操作条件范围内预测微载体悬浮行为。研究强调从拉格朗日微载体生命线视角而非直接从流体场获取水动力应力分布的重要性，因为在典型干细胞培养功率输入（P/V≈1 W/m³）下微载体不能完全悬浮和分散，无法均匀经历整个反应器的流体水动力环境。对于剪切敏感型干细胞微载体培养，体积功率输入0.5–3 W/m³范围内可获得良好的悬浮，混合时间约10–50 s，自由表面kLa约0.5–2 h⁻¹。该建模方法基于第一性原理，具有尺度无关性，可应用于更大规模反应器或其他培养系统，为干细胞治疗的工艺开发与理性放大提供基础，降低放大过程中的水动力风险并减少实验工作量。未来工作可扩展生命线分析以量化细胞或微载体暴露于特定ε阈值的频率和时间，并将其与细胞活力或分化潜能等实验数据相关联，从而建立水动力条件与细胞响应之间的机制性联系。