本研究由Yulong Tang、Yuji Niu、Wenxi Wang、Beibei Wu、Jianmin Jiang、Xu Qian、Yu Zhang、Sitao Xie及Weihong Tan等人完成，主要研究机构包括中国科学院杭州医学研究所（Hangzhou Institute of Medicine, HIM）浙江省临床检验中心、浙江省肿瘤医院、浙江中医药大学第二临床医学院、温州医科大学眼视光医院、上海交通大学医学院仁济医院分子医学研究所以及浙江省疾病预防控制中心。该研究以“brief communication”形式发表于 Science China Chemistry 期刊2025年12月第68卷第12期，属于“2025年新兴研究者专刊”（2025 Emerging Investigator Issue），文章于2025年9月1日收稿，2025年11月5日接受，2025年11月17日在线发表，DOI为10.1007/s11426-025-3122-0。
环状RNA（circular RNA, circRNA）是一类由前体mRNA反向剪接（back-splicing）产生的共价闭合单链非编码RNA，在细胞和生物体中展现出广泛的生物学功能。近年来，基于circRNA的疗法和疫苗开发取得显著进展，彰显了其临床应用潜力。然而，circRNA疗法仍面临关键技术瓶颈，包括高效环化序列的优化、翻译效率的增强以及体内递送系统的改进。
circRNA工程化设计围绕三个核心元件展开：自剪接内含子（self-splicing introns）、内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites, IRES）和开放阅读框（open reading frames, ORFs）。其中，IRES是调控翻译效率的核心元件，通过与IRES反式作用因子（IRES trans-acting factors, ITAFs）相互作用实现组织特异性表达。当前使用的IRES元件主要来源于病毒，面临三大挑战：其一，活性与长度的相关性——最佳翻译效率需400–800 nt的IRES序列形成复杂的二级/三级结构；其二，结构脆弱性——复杂结构易被RNA感受器（如PKR、OAS、ADAR）识别，导致翻译抑制和circRNA稳定性下降；其三，细胞类型依赖性——IRES元件在不同细胞类型中表现出异质性活性。
筛选短链IRES元件的核心考虑在于提高短抗原肽的表达效率。长链IRES在构建短抗原肽疫苗时，其复杂结构可能将目标短肽包裹在内部而阻碍翻译；同时，短链IRES还能有效减小核酸分子整体尺寸，更符合后续应用需求。因此，本研究旨在建立整合的生物信息学-实验平台，筛选长度小于100 nt的短IRES元件，以优化circRNA的翻译效率，特别是针对树突状细胞（dendritic cells, DCs）这一抗原呈递细胞类型。
本研究的工作流程可分为四个主要阶段。
第一阶段：短IRES文库的构建。 研究团队从IRESite和IRESbase两大数据库获取序列来源，聚焦于长度小于100 nt的元件，并利用已知IRES文库中的核糖体结合片段进行优化。筛选排除标准包括：（1）高GC含量序列，因其可能形成刚性茎结构而损害构象动力学和翻译；（2）长重复基序，可能阻碍IRES与核糖体/因子的相互作用。最终文库包含7,500个短IRES序列，来源分布为人类基因组39.12%、病毒基因组40.03%、其他来源20.85%。
第二阶段：体外筛选系统的建立与验证。 研究采用自剪接circRNA体系，结构为“mRuby-5′内含子-FEKL-IRES-SIIN-3′内含子”，其中mRuby作为红色荧光标记物，OVA257–264表位（SIINFEKL）作为模型抗原。SIINFEKL编码序列被拆分至两个内含子侧翼片段中，转录后由内源性核酸内切酶介导反向剪接以重构完整的SIINFEKL序列。该设计确保翻译依赖IRES且成功环化后才可表达。验证实验中，将IRES替换为CVB3 IRES、SIINFEKL替换为增强型绿色荧光蛋白（EGFP），转染HEK-293T细胞后mRuby与EGFP共表达，证实平台性能可靠。
筛选阶段将构建的IRES筛选体系转染入DCs，通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离mRuby和SIINFEKL双阳性细胞群。随后对选定细胞进行核糖体-新生链复合物测序（ribosome-nascent chain complex sequencing, RNC-seq）和生物信息学分析。该研究对RNC-seq进行了关键优化：（1）环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）介导的翻译停滞；（2）创新的线性RNA去除策略以最小化内源mRNA干扰并富集含有功能性IRES的circRNA。RNC-seq鉴定出682个具有IRES活性的序列，物种选择性显著：人源占72.73%（496/682，占人源候选的16.9%）、病毒源占8.94%（61/682，占病毒候选的2%）、其他来源占18.33%（125/682）。
第三阶段：候选IRES的体外验证。 从RNC-seq数据中选择20个核糖体关联性和富集度最高的IRES元件进行验证。工程化circRNA纳入这些IRES序列及密码子优化的抗原（SIINFEKL）和Kozak一致序列。在DC2.4树突状细胞中，携带IRES-1675和IRES-7328的circRNA在经H-2Kb/SIINFEKL染色检测的抗原呈递效率方面，相较IRES缺陷对照（CVB3和CrTMV）表现出略高的水平。RNAfold预测的二级结构分析揭示表现最优IRES具有保守结构域，包括假结（pseudoknots）、茎环基序（stem-loop motifs）和GNRA四环（tetraloops），这些结构可能通过稳定40S核糖体亚基结合所需的空间构象及暴露促进核糖体招募的动态调控位点来促进翻译。
第四阶段：体内免疫原性与抗肿瘤功效评估。 选择IRES-1675、IRES-6325、IRES-6275、IRES-7328以及对照CrTMV构建circRNA-SIINFEKL，以N/P比为6的比例装载入脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNP，含可电离脂质SM-102）。在C57BL/6小鼠尾基部皮下注射后，H-2Kb/SIINFEKL四聚体染色显示这些IRES在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中诱导的SIINFEKL特异性CD8+ T细胞频率与DPBS相当。与CrTMV相比，IRES-6325诱导的抗原特异性CD8+ T细胞频率相当。在鼠皮下EG7.OVA肿瘤模型中，IRES-6325表现出与IRES-CrTMV相当的肿瘤生长抑制和小鼠生存期延长效果。
RNC-seq鉴定结果为后续验证奠定了基础——从7,500个候选序列中锁定682个具有核糖体招募活性的短IRES，其中人源序列占比超过70%而病毒源贡献不足10%，这一发现提示人源短序列在DCs中可能具有天然优势。20个最高富集IRES的体外验证进一步缩小了候选范围，IRES-1675和IRES-7328在DC2.4细胞中的抗原呈递效率略优于传统对照，直接验证了高活性短IRES元件增强circRNA功能的可行性。
二级结构预测揭示了表现最优IRES具有假结、茎环和GNRA四环等保守结构域，为理解短序列如何维持翻译能力提供了机制解释——紧凑结构足以支持40S核糖体亚基结合及核糖体招募，同时避免长序列带来的结构脆弱性和突变风险。
体内实验结果与体外数据形成逻辑递进：候选IRES在小鼠体内能够诱导抗原特异性CD8+ T细胞应答，其中IRES-6325展现出与CrTMV相当的免疫原性和抗肿瘤功效，证明了短链IRES可在体内环境中有效驱动circRNA疫苗的抗原表达和免疫激活。
本研究成功建立了高通量IRES筛选平台，鉴定出功能性小于100 nt的IRES元件。这些元件在DCs中驱动circRNA翻译的效果与传统CVB3-IRES和CrTMV-IRES对照相当。工程化的未修饰小circRNA疫苗纳入这些IRES序列后，能够引发强效的抗原特异性CD8+ T细胞应答，在体内显著抑制肿瘤生长。该研究克服了IRES的长度依赖性，实现了IRES序列的集中化和精炼化，大幅降低了未来IRES序列突变的可能性。
科学价值方面，RNC-seq提供了核糖体结合circRNA的直接证据，机制上证明了紧凑IRES能够实现核糖体招募同时降低突变风险。应用价值方面，该研究专门针对抗原呈递细胞进行筛选，旨在鉴定最适合小circRNA疫苗的IRES序列，为个性化肿瘤疫苗和耐药逆转等应用开辟了潜在路径。
本研究的亮点包括：（1）提出并验证了短链IRES（<100 nt）在circRNA翻译中的可行性，突破了传统IRES的长度依赖性认知；（2）建立了整合RNC-seq与生物信息学的高通量筛选平台，特别是创新性的线性RNA去除策略有效富集了功能性circRNA；（3）筛选出的短IRES在体内外均展现出与长链对照相当甚至略优的翻译起始活性，且适用于抗原呈递细胞的特异性优化。
研究团队也明确指出局限性：筛选出的短IRES序列的高效率可能局限于筛选所用的特定细胞系，尚未在多种细胞类型中广泛验证。开发能够在多种细胞类型中实现高起始效率的IRES元件仍是终极目标。未来方向包括：整合AI预测的IRES功能模块与多细胞验证平台，精确工程化高表达、低毒性的circRNA疗法，以及利用机器学习驱动多组学筛选数据分析以设计通用型或组织特异性IRES。