该研究由Yessica Wouters、Tom Jaspers、Laura Rué、Lutgarde Serneels、Bart De Strooper和Maarten Dewilde等人完成，主要研究机构为VIB脑与疾病研究中心及KU Leuven。论文于2022年发表于*Fluids and Barriers of the CNS*期刊。

血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）药物开发面临的主要障碍之一。由于BBB限制治疗性蛋白进入脑实质，往往需要提高外周给药剂量才能在脑内达到有效浓度，这不仅增加副作用风险，也推高治疗成本。受体介导的转胞吞作用（receptor-mediated transcytosis, RMT）是利用BBB上表达的受体将药物从血液转运至脑内的一种策略。转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFR）是RMT研究中最为深入的靶点之一。此前该团队发现了一种抗小鼠TFR的VHH（又称纳米抗体，nanobody）NB62，能够将神经降压素（neurotensin, NT）递送至小鼠CNS。但NB62不识别人类TFR，限制了其临床转化潜力。因此，本研究旨在发现并验证一种抗人TFR的VHH，同时系统评估NB62和新型抗人TFR VHH能否递送具有治疗意义的抗体载荷进入CNS。

研究首先构建并比较了两种抗BACE1抗体1A11与NB62的融合形式。第一种为同源二聚体1A11wt-2xNB62，将两个NB62分别融合至1A11轻链；第二种为异源二聚体1A11am-NB62，将1A11的Fab片段和NB62分别融合至不同的Fc亚基。生物膜干涉技术（bio-layer interferometry, BLI）分析显示，1A11am-NB62表现出与单价NB62相似的结合动力学，其解离速率较快，表观亲和力为3.7×10⁻⁸ M；而1A11wt-2xNB62则表现出极慢的解离，表观亲和力为2.4×10⁻⁹ M，提示其发生了双价结合。由于此前实验表明双价NB62与NT融合后脑内递送效率显著下降，因此选择单价结合TFR的1A11am-NB62进行后续体内验证。以融合了无关抗GFP VHH的1A11am-agfp作为阴性对照。将两者以167 nmol/kg和16.7 nmol/kg的剂量静脉注射至C57BL/6野生型小鼠，24小时后检测血浆和脑内Aβ1-40水平。结果显示，两种融合抗体均能降低血浆Aβ1-40，表明外周BACE1被抑制；但只有1A11am-NB62在高剂量和低剂量下均能显著降低脑内Aβ1-40水平，高剂量下脑内Aβ1-40降低约45%，低剂量下降低约22%。这证明NB62能够将抗BACE1抗体递送至CNS并产生药效学效应。

为获得可识别人类TFR的脑穿透VHH，研究人员通过对羊驼进行人TFR免疫，构建了VHH展示噬菌体文库，库容量为10⁸个独立转化子。通过体外噬菌体展示筛选，获得了抗人TFR VHH NB188。NB188对人TFR的亲和力为6.4×10⁻⁹ M，比NB62对小鼠TFR的亲和力高约35倍。由于NB188不识别小鼠TFR，研究团队构建了人源化TFR小鼠模型（hAPI KI），即用人类TFR顶端结构域（apical domain）的编码序列替换小鼠TFR相应区域。蛋白质印迹分析显示，野生型、杂合子和hAPI KI小鼠脑内TFR表达水平无显著差异。NB62-NT融合蛋白在野生型小鼠中能引起体温下降，但在hAPI KI小鼠中该效应消失，证实了小鼠顶端结构域被成功替换。随后，将NB188与NT(8-13)融合并静脉注射至hAPI KI小鼠，观察到显著的体温下降，表明NB188能够穿越BBB进入CNS。

为了进一步验证NB188递送大分子治疗性抗体的能力，研究人员构建了1A11am-NB188异源二聚体抗体，并以1A11am-agfp作为对照，在hAPI KI小鼠中进行相同实验。结果表明，两种融合抗体均能降低血浆Aβ1-40，但只有高剂量（167 nmol/kg）的1A11am-NB188能显著降低脑内Aβ1-40水平，降低幅度约为50%。低剂量（16.7 nmol/kg）下1A11am-NB188未显示显著的脑内BACE1抑制效果，这与NB62在同等低剂量下仍有效形成对比，提示NB188的CNS递送效率可能低于NB62。

研究进一步进行了药代动力学/药效学（PK/PD）实验。1A11am-NB62和1A11am-NB188分别以167 nmol/kg单次静脉注射，于第1、3、7天检测血浆和脑内抗体浓度及Aβ1-40水平。结果显示，两种抗TFR融合抗体在血浆中的浓度均显著低于抗GFP对照抗体，表明存在靶点介导的清除（target-mediated clearance）。然而，在脑内，1A11am-NB62在第1天和第3天的浓度均显著高于对照，1A11am-NB188仅在第1天显著高于对照。与此一致，脑内Aβ1-40水平在两种抗TFR抗体处理组中于第1天和第3天均显著降低，第7天恢复至对照水平。外周血浆Aβ1-40水平在各组间无显著差异。NB188融合抗体从脑内清除更快，第1天至第3天脑浓度下降约94.1%，而NB62融合抗体下降约78.4%。这种差异可能归因于NB188对TFR的更高亲和力导致更强的靶点介导清除。

该研究的核心结论是：发现了抗人TFR特异性VHH NB188，其能够在全身给药后进入CNS；同时证明了NB62和NB188均能将具有治疗意义的抗BACE1抗体递送至脑内并产生药效学效应。研究提示NB62可作为小鼠中重要的研究工具，而NB188则有望作为增强治疗性蛋白向人类CNS递送效率的通用模块。

本研究的主要价值在于：第一，提供了一个经体内药效学验证的抗人TFR VHH，具有潜在的临床转化价值；第二，系统比较了单价和双价TFR结合对脑穿透效率的影响，进一步支持单价结合有利于RMT的观点；第三，使用BACE1抑制导致的脑内Aβ1-40降低作为明确的中枢靶点结合读数，避免了仅依赖体温变化等间接指标的局限性。研究的亮点包括：首次报道了抗人TFR VHH与治疗性抗体融合后的脑内药效学数据；构建了hAPI KI小鼠模型用于验证人源TFR结合物的BBB穿透能力；证明了低剂量NB62融合抗体即可在脑内产生药效，提示其递送效率可能优于部分已报道的抗TFR抗体平台。此外，研究还讨论了TFR作为BBB穿梭受体的优势与局限，指出TFR的广泛表达可能导致外周组织中的非特异性积累和靶点介导的快速清除，而具有BBB选择性表位的结合物可能避免这一问题。总体而言，该研究为基于VHH的CNS药物递送策略提供了重要的概念验证和工具分子。