一种新型“双生殖器官芯片”的开发：重现子宫子宫内膜与卵巢之间的双向内分泌互作
本文介绍的是由Se-Ra Park、Soo-Rim Kim等学者在2021年发表于期刊《Biofabrication》（第13卷，015001号）上的一项原创性研究成果。该研究团队主要来自韩国嘉泉大学（Gachon University）、翰林大学（Hallym University）医学院春川圣心医院、韩国毒理学研究所（Korea Institute of Toxicology）以及嘉泉大学吉医疗中心等机构。这项研究属于生物工程与生殖医学的交叉领域，具体聚焦于器官芯片（Organ-on-a-chip）技术和女性生殖系统体外模型的构建。
一、 研究背景与目标
女性生殖系统的正常功能高度依赖于子宫子宫内膜与卵巢之间复杂而精确的双向内分泌信号交流。例如，卵巢分泌的雌激素和孕激素调控子宫内膜的周期性变化，为胚胎着床做准备；而子宫内膜产生的某些信号分子，如前列腺素E2（PGE2），又反过来影响卵巢的排卵等功能。然而，传统的二维（2D）甚至简单的三维（3D）体外培养模型（如单层细胞培养或单一细胞类型的球体培养）存在显著局限：它们无法重现这种关键的器官间“对话”（内分泌互作），也难以模拟人体组织内由多种细胞类型构成的复杂微环境。这些局限导致传统模型在预测药物疗效或生殖毒性时，其结果往往与体内实际情况存在偏差，影响了药物研发的准确性和安全性评估。
因此，本研究旨在开发一种创新的“双生殖器官芯片”平台，以克服现有模型的不足。具体目标包括：1）构建一个集成子宫子宫内膜和卵巢组织的微流控芯片系统，通过共享培养基通道实现两者间的双向内分泌互作；2）在芯片内模拟两种组织的多细胞复杂性，将子宫内膜的多种细胞成分（干细胞、基质细胞、血管内皮细胞）与卵巢的两种关键滤泡细胞（颗粒细胞、膜细胞）分别整合到对应的腔室中；3）识别并验证一种可靠的、可通用的生殖毒性生物标志物；4）最终，结合该毒性标志物的报告系统，建立一个能够定量预测多种有害物质生殖毒性的高效芯片筛选平台。
二、 详细研究流程与方法
研究流程可概括为芯片设计与制造、细胞获取与表征、器官芯片构建与功能验证、毒性标志物发现与验证，以及最终整合形成毒性筛选平台。
第一，芯片模具的设计与制造。 研究团队首先使用计算机辅助设计（CAD）软件（SolidWorks 2009）设计了一个包含两个腔室的芯片结构：一个三角形的“子宫内膜腔室”和两个圆形的“卵巢腔室”，腔室之间通过媒体通道相连。利用数字光处理（DLP）3D打印机，使用光固化丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）聚合物，逐层打印出芯片的母模。然后，将聚二甲基硅氧烷（PDMS，一种常用于微流控芯片的生物相容性硅胶）注入母模，固化后剥离，得到最终的PDMS芯片平台。最终芯片尺寸为34×34×5 mm³，子宫内膜腔室尺寸为20×16×3 mm³，卵巢腔室为直径7 mm、高3 mm，连接通道为2×3×3 mm³。
第二，人类生殖系统细胞的获取与培养。 * 子宫内膜细胞： 从子宫肌瘤患者的正常子宫内膜组织中分离出具有干细胞特性的子宫内膜干细胞，并通过流式细胞术（检测CD34， CD44， CD45， CD73， CD105等表面标志物）和成脂/成骨分化实验验证其干细胞特性。同时，使用商业化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为血管内皮模型，人皮肤来源的成纤维细胞（CCD-986SK）作为基质细胞模型。 * 卵巢滤泡细胞： 从接受体外受精（IVF）治疗患者的卵泡液中分离出颗粒细胞和膜细胞。由于原代细胞增殖能力有限，研究通过转染SV40大T抗原来延长其寿命并建立细胞系。通过免疫荧光和Western blot检测促卵泡激素受体（FSHR）、促黄体生成素受体（LHR）、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的表达，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）验证其激素分泌功能，以确认细胞保留了其生理特征。
第三，“双生殖器官芯片”的组装与表征。 * 子宫内膜层构建： 将子宫内膜干细胞、基质细胞和血管内皮细胞按比例混合，悬浮于由I型胶原蛋白、透明质酸和琼脂糖组成的天然聚合物混合水凝胶中。该混合水凝胶在DMEM培养基中配制，包含胶原蛋白（2.5% w/v）、透明质酸（2.5% w/v）和琼脂糖（0.6% w/v）。将细胞-水凝胶复合物注入芯片的子宫内膜腔室，在室温下凝胶化，形成三维的人工子宫内膜层。 * 卵巢腔室填充： 将已建立的颗粒细胞和膜细胞系直接接种到芯片的卵巢腔室中。 * 机械与结构表征： 对合成的子宫内膜层进行了详细表征：1）扫描电子显微镜（SEM）观察显示其具有均匀互联的多孔结构（孔径100纳米至200微米），模拟了细胞外基质；2）压缩测试表明其机械强度约为18 kPa，与人类软子宫内膜的刚度范围（10-32 kPa）相符；3）流变学测试显示水凝胶具有剪切稀化特性，适合作为细胞支架。 * 细胞分布与存活： 用绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（mCherry）标记不同细胞后，证实它们在各自腔室内分布均匀。活/死染色实验表明，在静态培养14天后，两个腔室内的细胞存活率均保持在90%以上。关键发现是：当允许两个腔室通过连接通道进行培养基共享（模拟内分泌互作）时，培养14天后，子宫内膜腔室和卵巢腔室的细胞存活率分别比无互作的对照条件下提高了约5%和7%。这表明双向内分泌互作有助于维持细胞的长期活力。
第四，器官芯片的功能验证。 * 激素分泌： 通过ELISA检测，证实卵巢腔室能主动分泌雌激素和孕激素，而子宫内膜腔室能分泌PGE2。 * 受体表达： 免疫荧光染色显示，子宫内膜腔室中的细胞表达雌激素受体和孕激素受体，卵巢腔室中的细胞表达PGE2受体。 * 激素响应性： 用雌激素刺激子宫内膜腔室或用PGE2刺激卵巢腔室后，通过活/死染色和CCK-8代谢活性检测，均发现细胞活力和代谢活性显著增加。这些结果证明，芯片上的“器官”不仅保持了分泌关键信号分子的能力，也保留了对其配体的功能响应性，即芯片平台能够模拟体内生理特征。
第五，生殖毒性标志物SerpinB2的识别与验证。 为了建立毒性筛选平台，研究需要寻找一个敏感、通用的毒性反应标志物。研究团队将目光投向了SerpinB2（也被称为纤溶酶原激活物抑制剂-2， PAI-2）。 * 体外验证： 使用已知的强生殖毒性物质二噁英（Dioxin）处理子宫内膜干细胞以及颗粒细胞和膜细胞。结果显示，二噁英处理显著抑制了细胞生长、促进凋亡并降低迁移能力。更重要的是，在mRNA和蛋白质水平上，SerpinB2的表达均被二噁英显著上调。 * 生物信息学分析： 利用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件对公共基因表达数据库（如GEO数据库）中与凋亡、增殖相关的数据集进行分析，发现SerpinB2的上游正调节因子（如TGF， IL1B）在凋亡细胞中被激活，而在高增殖细胞中被抑制。进一步分析GEO数据库显示，在接触内毒素、香烟烟雾、苯等多种毒性物质后，多种细胞和组织中的SerpinB2表达也显著升高。这些证据共同支持SerpinB2可作为响应多种毒性刺激的可靠早期标志物。
第六，集成SerpinB2报告系统的毒性筛选平台构建与测试。 * 报告系统构建： 为了实现对毒性的定量、高通量检测，研究团队将SerpinB2启动子驱动的荧光素酶（luciferase）报告基因系统稳定转染入子宫内膜细胞和卵巢滤泡细胞中。 * 芯片平台整合： 将这些携带报告基因的细胞分别加载到对应的器官芯片腔室中。 * 毒性测试： 用二噁英处理芯片后，通过检测荧光素酶活性，证实芯片内的子宫内膜腔室和卵巢腔室的SerpinB2报告信号均显著增强。随后，研究扩大了测试范围，使用了一系列结构各异的已知有害物质（如马兜铃酸I、苯并芘、苯胺等）处理芯片。关键结果是：所有这些毒性物质都能显著增强两个腔室中的SerpinB2荧光素酶活性。这证明了该芯片平台结合SerpinB2报告系统，能够作为一种“通用”的生殖毒性预测工具，对不同种类的有害物质做出响应。
三、 主要研究结果
本研究取得了一系列从平台构建到功能应用的多层次结果： 1. 成功开发了物理平台：利用3D打印和PDMS复制技术，制造出了结构精确、包含互联腔室的双生殖器官芯片。 2. 实现了结构与功能的仿生：合成的子宫内膜水凝胶层具有与天然组织相似的孔隙结构和机械性能；细胞在芯片内长期存活且分布均匀。 3. 证实了双向内分泌互作的益处：腔室间的信号交流提高了细胞的长期存活率，证明该系统能模拟器官间相互支持的生理状态。 4. 验证了芯片的生理功能：芯片上的“器官”能分泌关键激素、表达相应受体并对激素刺激产生功能性响应。 5. 发现并验证了SerpinB2作为生殖毒性标志物：实验数据和生物信息学分析均强烈支持SerpinB2是响应多种毒性暴露的敏感且通用的早期指标。 6. 建立了集成化的毒性预测平台：将SerpinB2荧光素酶报告系统成功整合到器官芯片中，并证明该平台能定量检测多种有害物质的生殖毒性。
四、 结论与意义
本研究的核心结论是：成功创建了一种新型的“双生殖器官芯片”模型，它不仅更真实地模拟了人体内子宫子宫内膜与卵巢之间的多细胞复杂性和双向内分泌互作，而且通过整合SerpinB2毒性报告系统，发展成为一个高效的、可用于预测化合物生殖毒性的先进体外筛选平台。
这项研究的科学价值在于：1）推动了器官芯片技术的发展：提供了一种构建能模拟器官间相互作用的复杂多器官芯片系统的范本；2）深化了对生殖系统体外模型的理解：强调了在体外模型中重现细胞微环境和器官间通讯的重要性；3）提出了毒性评估新策略：将特定的生物标志物报告系统与仿生器官芯片相结合，为毒性测试提供了更敏感、更生理相关的新方法。
其应用前景广阔：1）药物研发：可用于更准确地筛选和评估新药候选物对女性生殖系统的潜在副作用，减少后期研发失败的风险；2）毒理学与安全性评估：为环境污染物、化妆品、化学品等的生殖毒性评估提供了一种新型、高效的体外测试工具，有望部分替代或补充动物实验；3）基础研究：该平台本身就是一个强大的研究工具，可用于研究女性生殖生理、病理机制（如子宫内膜异位症、不孕症）以及激素调节网络。
五、 研究亮点与创新性
本研究的亮点和创新性体现在多个方面： 1. 理念创新：首次将“双向内分泌互作”这一核心生理特征系统性地整合到女性生殖系统的器官芯片模型中，超越了以往单一器官或单向作用的模型。 2. 技术整合：将3D生物打印/微加工技术、多细胞3D共培养技术、天然生物材料工程以及报告基因技术巧妙地融为一体。 3. 标志物驱动的平台构建：并非单纯构建一个仿生模型，而是以识别和验证一个关键的生物学标志物（SerpinB2）为核心，进而构建一个功能导向的、具备定量输出能力的应用平台，使研究从“模型构建”迈向“问题解决”。 4. 多维度验证：对芯片平台进行了从物理结构、机械性能到细胞活性、激素分泌、受体表达、功能响应再到毒性预测能力的全面而严谨的验证，证据链完整。 5. 通用性潜力：SerpinB2报告系统对多种结构迥异的毒性物质均有响应，表明该平台具有预测“广泛生殖毒性”的潜力，而非仅针对某一类物质。
六、 其他有价值的内容
研究中提到，与传统的2D单层培养相比，在3D微流体芯片培养条件下，细胞对毒性物质（如二噁英）的敏感性（以SerpinB2 mRNA表达水平衡量）可能有所不同，有时甚至低于2D培养。作者客观地指出了这一点，并引用前人研究指出，3D培养中细胞形态、基因表达、药物可及性等会发生改变，可能导致不同的耐药性表现。这提示我们，3D器官芯片提供的是一种更接近体内复杂生理环境的毒性反应信息，其意义与简单的2D高通量初筛可能不同，两者在药物研发流程中或可互补。这种对模型局限性的讨论增加了研究的严谨性。
Se-Ra Park等人的这项工作，是生物制造和体外毒理学领域的一项标志性进展，它为开发更 Predictive（可预测的） 的人类生理和病理模型，以及更安全、更有效的药物筛选策略，提供了重要的技术支撑和新的思路。