一项关于酪氨酸激酶抑制剂心脏毒性多尺度转录组学特征的研究报告
作者与发表信息
这项研究由 Jens Hansen、Yuguang Xiong、Mustafa M. Siddiq、Priyanka Dhanan 等众多研究人员共同完成，其研究团队主要来自美国西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）的多个系所和研究所，同时包括迈阿密大学、克莱姆森大学、布法罗大学等其他机构的合作者。该研究论文以《Multiscale mapping of transcriptomic signatures for cardiotoxic drugs》为题，于2024年发表在 Nature Communications 期刊上。
学术背景与研究目标
本研究属于药物毒理学、系统生物医学和心血管科学的交叉领域。药物治疗，尤其是许多高效抗癌药如酪氨酸激酶抑制剂，常伴随器官特异性副作用，其中心脏毒性是一个严重问题，可能导致心力衰竭。药物引发的基因表达谱有助于识别其毒性机制，但目前尚缺乏对药物疗法相关心脏毒性的分子通路、细胞起源和基因组决定因素的系统性图谱绘制。
为此，本研究旨在通过实验识别药物诱导的转录组学特征，并将这些特征与公开可用数据进行整合，为未来多层次理解心脏毒性构建框架和生成假设。具体而言，研究者将焦点放在美国食品药品监督管理局批准的酪氨酸激酶抑制剂上，利用人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中的批量转录组学谱，来获取其心脏毒性的特征性“签名”。
详细研究流程
本研究的设计与执行包含多个相互关联的步骤，流程严谨且系统。
第一步：细胞模型构建与药物处理
研究使用了从六名健康个体皮肤成纤维细胞重编程而来的人诱导多能干细胞系。这些干细胞被分化为心肌细胞，构建了六个人诱导多能干细胞衍生心肌细胞系，作为研究药物心脏毒性的体外模型。
研究者选取了54种药物进行处理，其中包括27种酪氨酸激酶抑制剂、4种蒽环类药物以及23种其他心脏作用或非心脏作用的药物。酪氨酸激酶抑制剂根据临床研究和FDA不良事件报告系统数据，进一步分为10种有心脏毒性和17种无心脏毒性的两类。所有药物（除内皮素和肿瘤坏死因子-α外）均是美国食品药品监督管理局批准的，并使用治疗相关浓度对心肌细胞进行为期48小时的处理。每个细胞系/药物组合构成了一个独立的样本。同时，对未处理的对照组细胞也进行了转录组测序。
第二步：转录组数据生成与差异表达基因分析
处理后，对每个样本进行批量RNA测序。使用STAR软件将测序数据比对到人类参考基因组hg38，并通过edgeR软件包中的负二项式检验，识别每个处理样本相对于其自身未处理对照的差异表达基因。最终，生成了266个差异表达基因列表，每个列表代表一个独特的细胞系/药物组合的反应。
第三步：奇异值分解法识别药物选择性表达响应
这是本研究方法学的核心创新点。初步分析发现，原始的差异表达基因谱聚类主要由细胞系特异性效应或反应幅度（差异表达基因数量）主导，而药物选择性效应被掩盖。为了分离出真正由特定药物引发的、在不同个体细胞系间共享的转录特征，研究者采用了奇异值分解法。
奇异值分解法是一种数学矩阵分解技术，能够将一个复杂的基因表达数据矩阵分解为一组正交的“特征阵列”及其对应的系数。每个完整的差异表达基因谱都可以看作是这些特征阵列的线性组合。通过分析，研究者发现第一特征阵列与药物反应的普遍扰动幅度高度相关，其相关基因富集于肌肉收缩等一般性应激通路，从而掩盖了药物特异性效应。因此，他们移除了第一特征阵列。
随后，研究者开发了一套算法来评估剩余的特征阵列对特定药物或细胞系的区分能力。对于每种药物，算法会筛选并组合一组独特的“药物选择性特征阵列”，形成一个“药物选择性子空间”。构建子空间的目标是优化该药物在所有处理细胞系中的聚类效率，同时尽可能保留原始信息。算法还特别筛查了“异常值响应”，即某个细胞系对特定药物的反应显著不同于其他五个细胞系。最终，将原始的差异表达基因谱投影到各自确定的药物选择性子空间中，便得到了“药物选择性基因表达谱”。
第四步：通路富集分析与心脏毒性相关亚细胞过程识别
对药物选择性基因表达谱中上调和下调的基因分别进行通路富集分析。研究采用了“细胞分子生物学本体论”这一系统性的通路分类体系。该体系将亚细胞过程按功能层次分为1-4级，高级别描述更通用的功能，低级别描述更具体的过程。分析得到了每种药物/细胞系组合在不同层级上显著上/下调的亚细胞过程及其显著性排序。
为了识别与酪氨酸激酶抑制剂心脏毒性相关的特征性通路，研究者开发了另一种基于F1分数和曲线下面积的统计算法。该算法筛选出那些几乎只在有心脏毒性的酪氨酸激酶抑制剂中高排名上/下调，而在无心脏毒性的酪氨酸激酶抑制剂中很少出现的亚细胞过程。这些通路被认为是与心脏毒性响应相关的潜在特征。
第五步：映射到细胞类型与公开数据库进行整合验证
为了探究药物毒性可能影响的细胞类型，研究者将本研究中批量转录组学识别的关键亚细胞过程，与两个来源的数据进行映射：一是对本研究中使用其中四个细胞系进行的单细胞RNA测序数据重新分析所识别的细胞簇；二是已发表的健康及心衰患者成人心脏的单细胞/单核转录组数据。这种映射旨在判断药物影响的心肌通路是否也存在于成人心肌细胞或其他心脏细胞类型（如成纤维细胞）中。
第六步：结合全基因组测序识别潜在基因组变异
研究团队对所使用的六个细胞系进行了全基因组测序。结合转录组分析中发现的“异常值响应”，他们旨在识别可能与药物心脏毒性风险相关的基因组变异。其假设是：若某个细胞系对某种药物表现出异常反应，可能是由于其携带了影响该药物药代动力学/药效学或相关通路的基因变异。
研究者设定了变异筛选标准：人群等位基因频率≤10%（与心脏毒性发生率范围匹配），且变异位于基因编码区或是成人心脏中顺式表达/剪接数量性状位点的一部分。分析分为两方面： 1. 干扰药代动力学/药效学的变异：寻找在异常值响应细胞系中过量存在、且映射到该药物已知作用靶点、转运体、代谢酶或其上游调控因子（如转录因子）基因上的变异。 2. 干扰心脏毒性相关通路的变异：将与心脏毒性响应相关的关键亚细胞过程所涉及的基因，与全基因组测序中符合人群频率标准的变异进行映射，识别位于这些通路基因上的潜在功能变异。
第七步：内皮细胞共培养验证实验
为评估当前单一心肌细胞培养模型是否因缺乏其他心脏细胞（如内皮细胞）而影响毒性特征的获取，研究者选取了两种酪氨酸激酶抑制剂，在两个心肌细胞系中进行了与人心冠状动脉内皮细胞的共培养实验，并在相同条件下进行药物处理与转录组测序，以比较共培养与否对药物诱导的转录特征的影响。
主要研究结果
1. 奇异值分解法成功解耦并识别了药物选择性转录特征。 投影到药物选择性子空间后，相同药物处理的样本聚类效率显著提高。更重要的是，具有相似作用机制的药物（如所有靶向EGFR/ERBB2/ERK信号通路的酪氨酸激酶抑制剂）在聚类中自发地聚集在一起，这从生物学角度验证了该计算方法提取的特征具有合理性。算法还成功识别了24个药物的异常值响应样本。
2. 识别出与酪氨酸激酶抑制剂心脏毒性相关的特征性亚细胞过程。 通路富集分析揭示，有心脏毒性的酪氨酸激酶抑制剂倾向于共同调控一组特定的通路，其中包括： * 能量代谢与线粒体功能：如三羧酸循环和氧化磷酸化相关通路。值得注意的是，这与多数心衰模型中观察到的线粒体功能下调不同，提示某些心脏毒性药物可能诱发了一种代偿性的能量代谢上调。 * 收缩结构与肌节更新：涉及肌肉收缩和肌原纤维组装等通路。分析发现，有心脏毒性的酪氨酸激酶抑制剂倾向于下调这些通路，而无毒性的则倾向于上调，提示肌节更新不足可能与心脏毒性相关。这些通路与遗传性心肌病的发病机制重叠。 * 细胞外基质动力学：如胶原交联相关通路，这与心脏纤维化和心衰进展的病理特征相符。 * 其他过程：还包括与铁死亡、胆固醇代谢、利钠肽信号等相关的通路，这些均与已知的心脏病理生理过程或现有心脏保护治疗靶点相联系。
3. 毒性通路可映射到多种心脏细胞类型。 通过将上述亚细胞过程映射到公开的单细胞转录组数据，研究发现这些由酪氨酸激酶抑制剂调控的通路不仅存在于心肌细胞中，也在心脏成纤维细胞等非心肌细胞中活跃。这表明药物的心脏毒性效应可能是通过影响心脏内多种细胞类型协同实现的。
4. 成功验证并预测了与药物心脏毒性相关的基因组变异。 * 验证已知变异：通过整合全基因组测序和转录组异常值分析，研究成功地重新识别了与蒽环类药物心脏毒性因果相关的基因变异 rs2229774。该变异位于 RARG 基因编码区，能降低转录因子RARG对蒽环类药物靶点拓扑异构酶2B表达的抑制，从而增加毒性。这一结果为研究方法提供了强有力的验证。 * 预测新变异：基于上述方法，研究为三种蒽环类药物和三种有心脏毒性的酪氨酸激酶抑制剂，分别鉴定出128个和111个潜在的、可能干扰其药代动力学/药效学的基因变异。此外，通过将变异映射到心脏毒性相关的亚细胞过程，还识别出数百个可能通过干扰特定通路而影响心脏毒性风险的潜在变异位点。例如，在“薄肌丝组织”这一与心脏毒性下调相关的通路上，预测了13个映射到4个基因的变异，其中两个基因的功能恰好是新近获批的梗阻性肥厚型心肌病治疗药物Mavacamten的作用靶点。
5. 内皮细胞共培养对转录特征影响有限。 与人心冠状动脉内皮细胞共培养并未显著改变帕唑帕尼和达拉非尼诱导的心肌细胞转录组特征或相关通路预测，提示在初始筛选中仅使用心肌细胞模型可能足以识别潜在的心脏毒性化合物特征。
结论与意义
本研究的主要结论是：通过对人诱导多能干细胞衍生心肌细胞的短期药物处理，获得的mRNA表达谱，当与公开可用的基因组、通路及单细胞转录组数据集整合时，能够提供预测药物心脏毒性的“多尺度特征签名”。这些签名不仅揭示了毒性相关的分子通路和潜在的细胞类型来源，还能帮助识别可能与个体易感性相关的基因组变异。
本研究的科学价值和应用前景体现在多个层面： 1. 方法论创新：开发了一套基于奇异值分解的计算流程，能够从混杂的批量转录组数据中有效解耦并提取药物特异性反应成分，该方法可推广至其他需要从混合效应中分离特定信号的研究场景。 2. 机制见解：系统性地绘制了酪氨酸激酶抑制剂心脏毒性的潜在分子通路图谱，并提示其毒性机制可能通过模拟遗传性或获得性心肌病的病理过程，影响包括心肌细胞和成纤维细胞在内的多种心脏细胞。 3. 转化应用潜力： * 药物开发：在临床前阶段，利用此类转录组特征可预测候选化合物的心脏毒性风险，辅助早期筛选。 * 毒性缓解：识别出的关键通路可为开发减轻心脏毒性、但不影响抗癌疗效的联合用药或辅助疗法提供潜在靶点。 * 患者分层：预测的基因组变异可作为假设，用于设计针对性的临床研究，未来或能通过基因检测识别对特定药物心脏毒性高风险的患者，实现个体化用药。
研究亮点
局限性
作者也指出了研究的局限性，包括：仅关注了转录组层面的变化，而某些药物的直接蛋白抑制作用可能不依赖转录改变；使用的细胞系数量有限；药物处理仅在单一时间和浓度下进行，未能评估转录变化的可逆性；系统性的多细胞类型共培养研究尚不全面。这些为未来更深入的研究指明了方向。