Seung Yeon Baek 和 Mee Ree Kim 两位研究者来自韩国忠南大学（Chungnam National University）食品与营养学系，他们的研究论文《Neuroprotective Effect of Carotenoid-Rich Enteromorpha prolifera Extract via TrkB/Akt Pathway against Oxidative Stress in Hippocampal Neuronal Cells》于2020年7月19日发表在期刊《Marine Drugs》上。本研究属于海洋生物资源开发与神经保护交叉领域，旨在探讨富含类胡萝卜素的浒苔（Enteromorpha prolifera）乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract of E. prolifera, EAEP）对氧化应激诱导的海马神经元细胞损伤的保护作用及其分子机制。
神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的发生与活性氧（reactive oxygen species, ROS）过度生成密切相关。ROS可导致蛋白质和DNA损伤、炎症及组织损伤，并最终诱发神经元凋亡。因此，调控ROS生成成为预防和治疗神经退行性疾病的重要策略之一。另一种策略是通过激活脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）的产生来保护神经元。BDNF通过其受体原肌球蛋白相关激酶受体B（tropomyosin-related kinase receptor B, TrkB）发挥作用，促进细胞增殖、突触功能和可塑性。海洋海藻是丰富的天然抗氧化剂来源，含有类黄酮、酚类化合物、类胡萝卜素和叶绿素等活性成分。浒苔在东亚作为食品和传统药物使用已久，已有研究表明其多糖具有抗氧化、抗炎和抗凋亡活性，但关于其植物化学物对神经保护作用的研究较少。作者前期研究发现EAEP的抗氧化活性强于水提取物和95%乙醇提取物，并且EAEP富含类胡萝卜素衍生的二氢猕猴桃内酯（dihydroactinidiolide）以及角黄素（canthaxanthin）、紫黄素（violaxanthin）和岩藻黄素（fucoxanthin）等类胡萝卜素，这些成分已被报道具有神经保护活性。基于此，本研究旨在探讨EAEP对谷氨酸诱导的氧化应激海马神经元细胞HT-22的神经保护作用，并阐明其通过TrkB/Akt信号通路的作用机制。
研究的具体流程包括多个层次的实验。首先，作者评估了EAEP对谷氨酸诱导的HT-22细胞氧化应激的神经保护作用。HT-22细胞在96孔板中培养24小时后，在谷氨酸（5 mM）处理前30分钟加入不同浓度（0–100 µg/mL）的EAEP。谷氨酸是一种兴奋性神经递质，高浓度谷氨酸会抑制N-乙酰半胱氨酸摄取，导致细胞内谷胱甘肽水平下降，进而引发氧化应激和细胞凋亡。实验结果显示，EAEP预处理可剂量依赖性地提高细胞活力，其中100 µg/mL的EAEP能完全恢复细胞活力至对照组水平。同时，通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）荧光探针检测细胞内ROS水平，发现EAEP剂量依赖性地降低谷氨酸诱导的ROS生成，表明EAEP通过调控ROS生成减轻神经元细胞死亡。
其次，作者利用流式细胞术和Annexin V染色检测EAEP对氧化应激诱导凋亡的抑制作用。HT-22细胞在60 mm培养皿中培养并经过同样的EAEP和谷氨酸处理后，收集包括凋亡和坏死细胞在内的所有细胞进行染色分析。结果显示，谷氨酸处理显著增加凋亡小体数量，而EAEP预处理剂量依赖性地减少凋亡小体数量，100 µg/mL的EAEP使凋亡小体水平恢复至对照组水平，证明EAEP通过抑制氧化应激诱导的凋亡保护神经元细胞。
第三部分实验旨在揭示EAEP激活抗氧化酶表达的分子机制。已有研究表明Akt/Nrf2通路的激活影响神经保护活性。作者通过Western blot检测了p-Akt、核内和胞质Nrf2以及抗氧化酶HO-1、GCLC和NQO-1的表达。结果显示，EAEP处理上调了p-Akt表达和Nrf2的核转位，并提高了HO-1、GCLC和NQO-1的水平，说明EAEP的抗氧化作用可能通过Akt/Nrf2信号通路介导。
第四部分实验进一步探讨EAEP对BDNF表达及其上游信号通路的影响。作者检测了ERK/CREB/TrkB通路相关蛋白的表达，包括BDNF、p-ERK、p-CREB和p-TrkB。结果显示，EAEP完全增强了BDNF以及p-ERK、p-CREB和p-TrkB的表达。同时，作者检测了MAPK家族中的JNK和p38的磷酸化水平，发现谷氨酸处理增加了p-JNK和p-p38的表达，而EAEP显著抑制了它们的磷酸化。这些结果表明EAEP同时上调BDNF/ERK/CREB/TrkB信号通路并下调JNK和p38的激活。
为了验证TrkB/Akt通路在EAEP神经保护作用中的必要性，作者使用了TrkB抑制剂K252a和选择性Akt抑制剂MK-2206进行阻断实验。HT-22细胞在谷氨酸处理前30分钟与EAEP及抑制剂共同孵育。结果显示，K252a或MK-2206与EAEP联合预处理显著降低了EAEP对谷氨酸处理的HT-22细胞的神经保护作用，细胞活力下降，ROS水平升高。此外，两种抑制剂均逆转了EAEP对HO-1、NQO-1和GCLC等抗氧化酶表达的增强作用，并降低了BDNF和p-TrkB的表达。这些结果证明Akt的激活与BDNF/TrkB通路及抗氧化酶表达密切相关，EAEP通过激活TrkB/BDNF和Akt/Nrf2/抗氧化酶通路发挥氧化应激保护作用。
本研究的主要结论是，EAEP通过TrkB/Akt信号通路保护海马神经元细胞免受谷氨酸诱导的氧化应激和凋亡。EAEP不仅能提高细胞活力、减少ROS和凋亡小体形成，还能上调BDNF及HO-1、NQO-1、GCLC等抗氧化酶的表达。K252a和MK-2206的抑制实验进一步证实了TrkB/Akt通路的关键作用。EAEP富含类胡萝卜素衍生物，其神经保护作用可能归因于多种生物活性化合物的协同效应。本研究为EAEP作为预防和治疗神经退行性疾病的食品补充剂提供了科学依据，具有重要的应用价值。未来还需要动物实验进一步验证其体内神经保护效果。
本研究的亮点在于：首次报道了EAEP对氧化应激诱导神经退行性变的神经保护作用，并系统阐明了其通过BDNF/TrkB和Akt/Nrf2双通路协同作用的分子机制。研究不仅关注了抗氧化酶的表达调控，还深入分析了BDNF自分泌环路和MAPK家族中ERK与JNK/p38的差异调控，揭示了EAEP在促进神经元存活信号的同时抑制凋亡信号的双重作用。此外，EAEP来源于海洋绿藻浒苔，原料资源丰富且具有传统食用和药用背景，其富含的类胡萝卜素和多酚类化合物为开发天然来源的神经保护剂提供了新的候选物。该研究的实验设计层次清晰，从细胞活力、ROS水平、凋亡检测到信号通路蛋白表达和特异性抑制剂验证，形成了完整的证据链，为后续深入研究和应用转化奠定了坚实基础。