丁苯酞在脑缺血/再灌注小鼠模型中的保护作用：基于LC-MS/MS代谢组学的机制研究

本研究由来自首都医科大学宣武医院脑血管病研究所及神经内科（Yangmin Zheng, Fangfang Zhao, Yue Hu, Feng Yan, Yue Tian, Rongliang Wang, Yuyou Huang, Liyuan Zhong, Yumin Luo*, Qingfeng Ma）以及北京老年病医学研究中心及北京市脑血管病转化医学重点实验室（Yangmin Zheng, Feng Yan, Rongliang Wang, Yumin Luo, Qingfeng Ma）的研究团队共同完成。研究论文《LC-MS/MS metabolomic profiling of the protective butylphthalide effect in cerebral ischemia/reperfusion mice》于2023年9月14日在线发表于学术期刊 journal of stroke and cerebrovascular diseases 第32卷。

一、 学术背景 本研究属于神经科学与药理学交叉领域，聚焦于缺血性脑卒中（缺血性卒中）的治疗机制研究。缺血性脑卒中是全球范围内致残和死亡的主要原因之一。尽管静脉溶栓和血管内取栓是急性期的主要治疗手段，但受限于时间窗和出血风险，许多患者的疗效和预后不佳。脑缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤是指缺血脑组织在血流恢复后，损伤反而加重的复杂病理过程，涉及氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍等多个环节。因此，寻找更有效的治疗策略以减轻I/R损伤至关重要。

丁苯酞（Butylphthalide, NBP）是一种从芹菜籽中提取并人工合成的光学异构体，具有高脂溶性，可快速穿透血脑屏障，在中国已被广泛应用于缺血性脑卒中的临床治疗。大量研究表明，NBP具有抑制自由基损伤、减轻炎症、保护血脑屏障、改善脑能量代谢等多重神经保护作用。然而，其确切的、系统性的作用机制，特别是在整体代谢层面的调控网络，尚未完全阐明。

代谢组学（Metabolomics）是一种对生物系统在特定时间和条件下所有小分子代谢物进行定性和定量分析的技术，能够全景式地揭示生物体在病理生理刺激下内源性代谢物的动态变化规律，并关联到具体的代谢通路。近年来，非靶向代谢组学（Untargeted metabolomics）技术因其不依赖于先验知识、能够进行探索性发现的优势，在疾病机制研究和生物标志物发现中显示出巨大潜力。本研究旨在利用LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）非靶向代谢组学技术，探究NBP干预对脑I/R损伤小鼠外周血代谢谱的影响，筛选关键的差异代谢物及其相关代谢通路，从而系统性地揭示NBP发挥脑保护作用的代谢调控机制。

二、 详细研究流程 本研究设计严谨，包含动物模型构建与药效验证、样本采集与处理、代谢组学分析、数据统计与通路分析等多个环节。

1. 动物模型构建与分组：

   • 研究对象：成年雄性C57BL/6J小鼠（21-24克）。
   • 模型制备：采用可逆性大脑中动脉阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）方法制备小鼠脑I/R模型。具体为阻塞右侧大脑中动脉45分钟后恢复血流（再灌注）。
   • 实验分组：小鼠被随机分为三组：
     • 假手术组（Sham）：仅进行手术暴露，不插入线栓阻塞血管（n=10）。
     • 脑缺血/再灌注组（I/R）：接受MCAO手术（n=10）。
     • NBP治疗组（I/R+NBP）：在再灌注后立即通过尾静脉注射NBP（14 mg/kg），治疗1天（n=10）。
   • 伦理批准：所有动物实验均获得首都医科大学宣武医院机构动物护理和使用委员会的批准。

2. 神经功能评估与脑梗死体积测量（药效学验证）：

   • 目的：确认MCAO模型成功，并验证NBP的治疗效果。
   • 神经行为学评分：在术后24小时进行。
     • 平衡木测试（Beam-walking test）：评估小鼠运动协调能力，记录其1米内后肢悬空/滑落的时间。
     • 胶带移除测试（Adhesive removal test）：评估感觉运动功能，记录小鼠首次用嘴接触左前肢胶带的时间（接触时间）和完全撕掉胶带的时间（移除时间）。
     • 样本量：每组n=6-9。
   • 脑梗死体积测量：术后24小时处死小鼠取脑。
     • 方法：将脑组织切成1毫米厚切片，用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色。正常脑组织染成红色，梗死区域为白色。
     • 分析：使用ImageJ软件计算对侧半球体积和非梗死侧半球面积，通过公式（对侧半球体积 - 同侧非梗死半球体积）/ 对侧半球体积计算实际梗死体积百分比。
     • 样本量：每组n=6。

3. 血清样本采集与制备：

   • 时间点：MCAO手术后24小时。
   • 方法：麻醉小鼠，从下腔静脉采血（0.5-1 ml）至柠檬酸钠抗凝管中。
   • 处理：4°C下3000 rpm离心10分钟，取上清（血浆），于-80°C保存备用，用于后续LC-MS代谢组学分析。
   • 样本量：每组n=4。

4. LC-MS/MS非靶向代谢组学分析：

   • 仪器平台：采用高效液相色谱仪（Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000）与质谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用系统。
   • 色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C8柱。流动相A为乙腈/水，B为异丙醇/乙腈，进行梯度洗脱。
   • 质谱条件：采用HESI离子源，正负离子模式分别采集数据。全扫描分辨率为70,000 FWHM，扫描范围m/z 100-1500。
   • 数据采集：对Sham、I/R、I/R+NBP三组小鼠的血浆样本进行非靶向代谢物检测。

5. 数据处理与统计分析：

   • 数据预处理：使用Compound Discoverer 2.1软件进行原始数据提取和预处理。
   • 多元统计分析：
     • 主成分分析（PCA）：首先进行无监督的PCA分析，观察各组样本的整体分离趋势。
     • 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）：随后进行有监督的OPLS-DA分析，以最大化组间差异，并生成S-Plot图来识别对分类贡献显著的变量（潜在生物标志物）。
   • 差异代谢物筛选：结合OPLS-DA模型的变量重要性投影（VIP）值>1、单变量t检验p值<0.05以及倍数变化（Fold Change, FC）≥2或≤0.5，筛选差异代谢物。通过火山图（Volcano plot）可视化筛选结果。
   • 代谢物鉴定：将筛选出的差异代谢物与METLIN、HMDB和ChemSpider数据库进行比对，完成结构鉴定。
   • 代谢通路富集分析：使用MetaboAnalyst 4.0平台，基于KEGG数据库对鉴定出的差异代谢物进行通路富集分析，找出受显著影响的生物学通路。

三、 主要研究结果 1. NBP改善脑I/R损伤后的神经功能并减小梗死体积： * 行为学测试显示，与I/R组相比，NBP治疗组小鼠在平衡木测试中的评分显著改善（p = 0.0002），在胶带移除测试中的接触时间（p = 0.0023）和移除时间（p = 0.009）均显著缩短，表明NBP有效改善了小鼠的运动协调和感觉运动功能。 * TTC染色结果显示，I/R组的脑梗死体积百分比为40 ± 2.633%，而NBP治疗组显著降低至25.5 ± 2.68%（p = 0.0032）。这直接证明了NBP能显著减轻脑缺血损伤。

1. 血清代谢谱发生显著改变：

   • 层次聚类热图显示，三组样本的代谢谱存在明显分离，表明I/R损伤引起了显著的代谢紊乱，而NBP干预能够改变I/R后的代谢物组成。
   • PCA得分图证实了Sham、I/R和I/R+NBP三组在代谢状态上存在明显差异。

2. 筛选并鉴定出关键的差异代谢物：

   • 通过OPLS-DA模型（模型质量参数R2Y和Q2值均良好）和严格的筛选标准（VIP>1, p<0.05, FC≥2或≤0.5），研究聚焦于在I/R vs. Sham中下调、同时在I/R+NBP vs. I/R中上调的代谢物。
   • 最终共鉴定出88种显著差异代谢物。其中具有代表性的包括：
     • 脂质及类脂分子：雌二醇（Estradiol）、辅酶Q2（Ubiquinone-2）、17-羟基孕酮（17-Hydroxyprogesterone）、17α-乙炔基雌二醇（17-alpha-Ethinyl estradiol）、视黄酯（Retinyl ester）。
     • 有机酸及其衍生物：2-氧代精氨酸（2-Oxoarginine）、L-组氨酸三甲基甜菜碱（L-Histidine trimethylbetaine）。
     • 其他：吲哚丙酮酸（Indolepyruvate）等。

3. 揭示NBP调控的关键代谢通路：

   • 对上述差异代谢物进行KEGG通路富集分析，发现它们显著富集于多条代谢通路中，主要包括：
     • 氨基酸代谢：精氨酸和脯氨酸代谢（Arginine and proline metabolism）、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、组氨酸代谢（Histidine metabolism）、色氨酸代谢。
     • 能量代谢与氧化应激：氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、辅酶Q及其他萜醌生物合成（Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis）。
     • 激素信号通路：雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、GnRH分泌、孕酮/雄激素/雌激素受体激动剂/拮抗剂、卵巢类固醇生成、催乳素信号通路。
   • 具体代谢物变化示例：
     • 氨基酸相关：与Sham组相比，I/R组小鼠血清中2-氧代精氨酸（精氨酸衍生物）和L-组氨酸三甲基甜菜碱（组氨酸衍生物）水平显著下降（FC分别降至0.090和0.092）。NBP治疗后，两者水平显著回升（FC分别升至10.771和21.159）。这提示NBP可能通过调节精氨酸和组氨酸代谢，发挥神经保护作用。精氨酸减少与脑梗死严重程度相关，而组氨酸可通过血脑屏障转化为具有神经保护作用的组胺。
     • 能量与抗氧化：I/R后，具有抗氧化作用和参与线粒体电子传递的辅酶Q2水平下降（FC=0.267），NBP治疗后其水平显著升高（FC=8.228）。这表明NBP可能通过上调辅酶Q，改善I/R引起的氧化磷酸化功能障碍和氧化应激。
     • 性激素相关：I/R后，雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、17-羟基孕酮等性激素水平显著降低。NBP治疗后，这些激素水平大幅上调（例如雌二醇FC升至89.739）。这些代谢物富集于雌激素信号通路等多个与神经保护相关的激素通路，提示NBP的脑保护作用可能部分通过调节内源性性激素水平来实现。

四、 研究结论 本研究首次利用LC-MS/MS非靶向代谢组学技术，系统描绘了丁苯酞（NBP）在脑缺血/再灌注小鼠模型中的血清代谢谱调控网络。研究发现，NBP能够通过调节小鼠内源性物质的代谢平衡，发挥显著的脑保护治疗作用。其作用机制涉及多靶点、多通路的协同调控： 1. 调节氨基酸代谢：纠正脑I/R损伤引起的精氨酸、组氨酸等氨基酸代谢紊乱，可能通过影响神经递质、抗氧化和抗炎等途径发挥作用。 2. 改善能量代谢与减轻氧化应激：上调辅酶Q2水平，可能增强线粒体氧化磷酸化功能，清除氧自由基，从而对抗I/R损伤中的能量危机和氧化损伤。 3. 调控性激素信号通路：显著提升血清中雌二醇、孕酮等激素水平，激活相关的神经保护信号通路（如雌激素信号通路），这为理解NBP的神经保护作用提供了新的视角。

本研究从代谢组学层面揭示了NBP治疗脑缺血损伤的复杂药理特性，即其疗效并非通过单一靶点，而是通过协同调控氨基酸代谢、能量代谢和激素信号等多条关键通路来实现的。这为深入理解NBP的作用机制提供了全新的理论依据和研究线索。

五、 研究亮点 1. 方法学创新：首次将LC-MS/MS非靶向代谢组学技术应用于研究NBP对脑I/R损伤的全身性代谢调控作用，提供了全局性、系统性的机制视角。 2. 发现新颖：不仅验证了NBP对已知通路（如氨基酸代谢、氧化应激）的调节，更重要的是发现了NBP能显著影响内源性性激素（如雌二醇、孕酮）水平，并富集于相关的神经保护信号通路，这是一个先前未被充分重视的作用机制。 3. 多靶点协同作用的证据：研究结果以详实的代谢物数据为基础，清晰地展示了NBP同时作用于多个代谢网络（氨基酸、能量、激素），强有力地支持了其“多靶点协同”的药理特性假说。 4. 转化价值：筛选出的差异代谢物（如2-氧代精氨酸、L-组氨酸三甲基甜菜碱、辅酶Q2、雌二醇等）有潜力作为评估脑I/R损伤严重程度或NBP治疗效果的潜在生物标志物。

六、 其他有价值的内容与局限 * 研究价值：本研究为NBP的临床应用提供了更深入的代谢层面的科学解释，也为开发基于代谢组学的脑卒中疗效监测和预后评估新方法奠定了基础。 * 研究局限：作者在讨论中也指出了本研究的几点局限性： 1. 本研究仅为非靶向代谢组学的筛选性研究，尚未对关键通路中的多个上下游代谢物进行靶向验证（Targeted metabolomics），以确定代谢通路的完整变化。 2. 未对筛选出的差异代谢物进行预测疾病能力的统计分析（如绘制ROC曲线或构建预测模型）。 3. 代谢组学本身存在不确定性，可能受到小鼠自身状态（如呼吸、胃肠道微生物）的影响。 4. 实验设计中存在潜在混杂因素，如模型制备是分批进行的，尽管尽力缩短实验周期以减少误差，但仍可能引入批次效应。

尽管存在这些局限，本研究通过先进的代谢组学技术，成功勾勒出NBP发挥脑保护作用的复杂代谢图谱，为后续更深入的机制研究和临床转化开辟了新的道路。