本研究由Nan Li、Tingting Zhao、Yongtong Cao、Haojun Zhang、Liang Peng、Yan Wang、Xuefeng Zhou、Qian Wang、Jialin Li、Meihua Yan、Xi Dong、Hailing Zhao和Ping Li等人完成，主要通讯作者为Hailing Zhao和Ping Li。研究单位包括中国医学科学院北京协和医学院研究生院、中日友好医院临床医学研究所免疫介导炎症性疾病北京市重点实验室以及中日友好医院检验科。该研究于2021年1月29日发表在Frontiers in Pharmacology期刊上，文章标题为“Tangshen Formula Attenuates Diabetic Kidney Injury by Imparting Anti-Pyroptotic Effects via the TXNIP-NLRP3-GSDMD Axis”。

从学术背景来看，本研究属于肾脏药理学和糖尿病并发症研究领域。糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病严重的微血管并发症，也是终末期肾病的主要原因。DKD的发病机制复杂，涉及血流动力学紊乱、氧化应激、慢性炎症损伤、肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度激活以及血脂异常等。近年来，肾脏固有细胞的焦亡（pyroptosis）与DKD的关联逐渐受到关注，但相关证据仍然有限。焦亡是一种程序性细胞死亡形式，经典焦亡通路依赖活化的caspase-1，而非经典通路则由caspase-4/5/11介导。焦亡执行蛋白gasdermin D（GSDMD）可被活化的caspase切割，其N端片段具有成孔活性，破坏细胞膜完整性，导致细胞内容物和促炎细胞因子释放。炎症小体（inflammasome）是触发焦亡的重要上游机制，其中NLRP3炎症小体被研究得最为深入。NLRP3炎症小体由模式识别受体NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白ASC和caspase-1组成，激活后可使caspase-1前体自我切割为活化形式，进而将IL-1β和IL-18前体切割为成熟形式并分泌，发挥炎症效应。氧化应激在DKD进展中起关键作用，活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度产生是NLRP3炎症小体活化的重要因素。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是氧化应激的细胞调节因子，可通过抑制硫氧还蛋白的抗氧化活性加剧氧化应激，并可激活NLRP3炎症小体。糖肾方（Tangshen Formula，TSF）是一种治疗DKD的中药复方，前期临床研究表明其可减少IV期DKD患者的巨量蛋白尿、提高估算肾小球滤过率、改善血脂异常和腹围，但TSF的肾脏保护机制是否与抗焦亡作用相关尚不明确。本研究旨在探讨TSF是否通过TXNIP-NLRP3-GSDMD轴发挥抗焦亡作用，从而减轻糖尿病肾损伤。

在实验流程方面，本研究包括体内动物实验和体外细胞实验两大部分。体内实验中，研究者采用右侧单肾切除加一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法建立DKD大鼠模型。具体操作流程为：6周龄Sprague Dawley大鼠先行右侧单肾切除术以加速DKD进程，术后7天腹腔注射40 mg/kg STZ，注射3天后检测血糖，血糖水平大于16.7 mmol/L的大鼠被认定为糖尿病模型并随机分为模型组和TSF治疗组。对照组大鼠接受假手术，7天后腹腔注射柠檬酸缓冲液。实验共分为三组：对照组、模型组和TSF治疗组，每组6只大鼠。TSF以0.5%羧甲基纤维素钠溶液悬浮后灌胃给药，剂量为2.4 g/kg体重/天，相当于临床剂量的6倍，治疗持续20周。实验期间每4周检测血糖和24小时尿蛋白，实验结束时收集血清和肾组织进行后续评估。组织学检查包括H&E染色评估肾小管间质损伤、Masson三色染色评估间质纤维化、PAS染色评估系膜区细胞外基质沉积。此外，还通过免疫组织化学染色检测肾组织中GSDMD、NLRP3和IL-1β的表达，通过免疫荧光染色检测caspase-1与GSDMD或NLRP3的共定位情况，通过Western blot检测成熟IL-1β和IL-18的表达。体外实验使用人近端肾小管上皮细胞系HK-2，以200 μg/ml AGE-BSA刺激48小时诱导细胞损伤。为确认细胞焦亡的存在，在AGE刺激前用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK预处理细胞30分钟。为评估TSF的作用，使用250 μg/ml和500 μg/ml两种浓度的TSF与AGE共处理细胞。为明确TSF是否通过抑制NLRP3炎症小体发挥抗焦亡作用，在AGE和TSF共处理的基础上加入NLRP3炎症小体外源性激动剂尼日利亚菌素（nigericin），在收集细胞前1小时加入。细胞实验的检测方法包括钙黄绿素-AM/碘化丙啶双染色鉴定活细胞和死细胞，Western blot检测GSDMD-N端片段、cleaved caspase-1、NLRP3、IL-1β、IL-18和TXNIP的表达，ELISA检测细胞上清中IL-1β水平，DHE探针检测ROS产生，免疫荧光检测TXNIP与NLRP3的共定位。

研究结果显示，在体内实验中，DKD大鼠的血糖水平维持在较高水平（≥23.1 ± 0.85 mmol/L），TSF治疗对血糖无显著影响。DKD大鼠的24小时尿蛋白从实验第16周起显著高于对照组，而TSF治疗组大鼠的24小时尿蛋白未明显升高。组织病理学检查显示DKD大鼠出现肾小管上皮细胞肿胀、脱落、空泡变性以及明显炎症细胞浸润，部分扩张的肾小管管腔中可见管型和细胞碎片，TSF治疗可显著缓解这些病变。Masson染色半定量分析显示DKD大鼠肾小管间质纤维化增强，TSF治疗可减轻纤维化程度；PAS染色显示DKD大鼠肾小球系膜基质扩张增强，TSF可减轻这一变化。免疫组织化学和Western blot结果表明DKD大鼠肾组织中GSDMD、NLRP3、IL-1β、成熟IL-1β和成熟IL-18的表达均显著升高，而TSF治疗可下调这些分子的表达。免疫荧光显示caspase-1与GSDMD或NLRP3的共定位主要位于肾小管，DKD大鼠的共定位显著高于对照组，TSF可有效抑制焦亡相关蛋白的共定位。体外实验中，AGE刺激48小时后HK-2细胞的钙黄绿素阳性细胞比例显著降低，碘化丙啶阳性细胞比例显著升高，表明细胞死亡增加。使用caspase-1抑制剂YVAD预处理后，死亡细胞数量显著减少，GSDMD-N端片段和cleaved caspase-1的表达也显著降低，证实AGE诱导的细胞死亡主要是caspase-1依赖性的焦亡。TSF以剂量依赖性方式减少焦亡细胞数量及GSDMD-N和cleaved caspase-1的表达。在NLRP3炎症小体激活方面，AGE刺激后HK-2细胞中NLRP3、cleaved caspase-1和成熟IL-1β的表达随时间依赖性增加，细胞上清中IL-1β水平也升高，而TSF以剂量依赖性方式降低上述分子表达和IL-1β释放。使用尼日利亚菌素后，TSF对焦亡细胞比例的抑制作用被取消，TSF对GSDMD-N、cleaved caspase-1和NLRP3蛋白表达的抑制作用也被部分逆转，说明TSF主要通过抑制NLRP3炎症小体来减少焦亡。在氧化应激方面，AGE刺激的HK-2细胞中ROS产生显著增加，TXNIP表达上调，TXNIP与NLRP3的共定位增强，而TSF处理可降低ROS产生、TXNIP表达及TXNIP-NLRP3共定位。

本研究的主要结论是：TSF通过TXNIP-NLRP3-GSDMD轴发挥抗焦亡作用，保护肾小管上皮细胞免受焦亡损伤，这可能是TSF治疗DKD的重要机制之一。研究的意义在于揭示了中药复方TSF肾脏保护作用的新机制，即通过抗氧化应激、抑制TXNIP-NLRP3相互作用、减少NLRP3炎症小体激活、降低caspase-1活化，最终抑制GSDMD介导的肾小管上皮细胞焦亡。这一发现为DKD的焦亡机制提供了新的实验证据，也为TSF的临床应用提供了更深入的理论依据。此外，研究还提示ROS-TXNIP可能是TSF的作用靶点之一，为后续研究TSF有效成分及焦亡调控机制指明了方向。

本研究的亮点包括：首次系统性地在体内和体外实验中证实TSF通过抑制肾小管上皮细胞焦亡来减轻糖尿病肾损伤；明确了TSF的抗焦亡作用依赖于NLRP3炎症小体的抑制，并通过外源性NLRP3激动剂尼日利亚菌素反向验证了这一机制；将ROS-TXNIP-NLRP3-GSDMD轴作为一个整体来阐释TSF的作用机制，揭示了氧化应激与焦亡在DKD中的联系。研究也存在一定局限性，例如仅关注了NLRP3相关的焦亡，未探讨其他炎症小体如pyrin炎症小体和AIM2炎症小体的作用；同时，尚不清楚TSF中哪些具体成分对抗焦亡效应起主要作用。