本研究由Hızlan Hıncal Ağuş、Cenk Kığ和Mustafa Kaçmaz共同完成，三位作者分别来自İstanbul Yeni Yüzyıl University和İstanbul University的分子生物学与遗传学系。该论文于2024年发表于*Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi*（BSEU Journal of Science）第11卷第1期，页码为174至182页，出版日期为2024年。
本研究的学术背景主要围绕二甲双胍（metformin）这一广泛用于2型糖尿病治疗的一线药物展开。尽管二甲双胍在临床上已使用多年，其在细胞生理学中的作用机制仍未被完全阐明。近年来，许多研究提出二甲双胍可能具有抗癌和抗衰老的第二适应症，但其细胞毒性及背后的生理机制尚需进一步解析。为了探究二甲双胍引起的细胞死亡机制，研究者选择粟酒裂殖酵母（*Schizosaccharomyces pombe*）作为单细胞真核模式生物。粟酒裂殖酵母在细胞能量代谢、线粒体功能以及程序性细胞死亡机制方面与高等真核生物具有高度相似性，因此适合用于药物筛选和细胞死亡机制研究。本研究的主要目标是明确二甲双胍对粟酒裂殖酵母的细胞毒性效应，解析其诱导的细胞死亡类型（尤其是凋亡），并探讨线粒体应激、活性氧（ROS）水平以及相关基因表达变化在其中的作用。
研究工作的详细流程包括多个实验步骤。首先，研究者使用粟酒裂殖酵母ED666菌株及突变菌株（pca1δ、aif1δ和rad9δ）作为实验对象。酵母细胞在含1%酵母提取物和2%葡萄糖的YEL液体培养基中，于30°C、150 rpm条件下培养过夜，并将细胞浓度调整至1×10⁶ cells/mL用于后续处理。二甲双胍以无菌蒸馏水配制，浓度范围为0至20 mM，处理时间为24小时。细胞毒性首先通过亚甲蓝（methylene blue）染色评估细胞死亡率，每组至少计数200个细胞，生物学重复5次。同时，通过菌落形成实验（colony-forming assay）检测细胞存活率，将处理后的细胞按1：10稀释后涂布于YE琼脂平板，30°C培养3天后计算菌落数，以处理组与对照组的比值表示存活率。
细胞凋亡的检测采用Annexin V-FITC/PI双染法和DAPI染色法。Annexin V-FITC可特异性结合外翻至细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸，从而标记早期凋亡细胞；碘化丙啶（PI）可进入死亡细胞并染色细胞核，用于区分坏死细胞。实验中使用10 mM和20 mM二甲双胍处理细胞，经酶解去除细胞壁后，在荧光显微镜下观察并计数超过250个细胞，每组5次重复。DAPI染色用于检测细胞核DNA片段化，这是凋亡的典型标志之一。在10 mM和20 mM二甲双胍处理组中，DNA片段化细胞比例分别为4.1%和9.87%，与Annexin V/PI染色所得到的凋亡率趋势一致。
ROS水平的检测使用DCFDA染色法。DCFDA进入细胞后被氧化为具有绿色荧光的DCF，荧光强度反映细胞内氧化应激水平。结果显示，10 mM和20 mM二甲双胍处理组中DCF荧光强度分别下降1.19倍和1.58倍，表明二甲双胍降低了ROS的产生。与此同时，通过实时荧光定量PCR检测抗氧化酶基因sod1和gpx1的mRNA表达水平，发现各浓度处理组中这两个基因的表达保持稳定，说明抗氧化酶系统并未因二甲双胍处理而发生显著变化。
线粒体跨膜电位（ΔΨm）的检测采用罗丹明123（rhodamine 123）染色法。罗丹明123可被活性线粒体摄取并发出绿色荧光，荧光强度与线粒体跨膜电位呈正相关。实验结果显示，10 mM和20 mM二甲双胍处理组中荧光强度分别增加1.38倍和1.51倍，呈剂量依赖性升高。这一结果表明二甲双胍引起线粒体跨膜电位的显著上升，可能与线粒体功能改变和凋亡信号传导相关。
在基因表达分析方面，研究者通过实时荧光定量PCR检测了促凋亡相关基因pca1、aif1、rad9和cnx1的mRNA表达水平。结果显示，pca1、aif1和rad9的表达在二甲双胍处理后未发生显著变化，而cnx1的表达在10 mM处理组中显著上升1.9倍（P<0.05），在20 mM处理组中上升1.4倍但差异不显著。为了进一步验证这些基因在二甲双胍诱导凋亡中的作用，研究者使用rad9δ、pca1δ和aif1δ突变菌株进行菌落形成实验，结果发现这些突变菌株的死亡率与野生型相比没有显著差异，提示这三个基因可能不参与二甲双胍诱导的细胞死亡过程。而cnx1基因的显著上调则表明其可能在二甲双胍诱导的内质网应激相关凋亡中发挥关键作用。
本研究的主要结果可以归纳为以下几点：首先，二甲双胍对粟酒裂殖酵母具有剂量依赖性的细胞毒性，IC25值为20 mM。细胞死亡主要通过凋亡途径介导，10 mM和20 mM处理组中凋亡率分别为10.05%和20.49%，与总死亡率接近。其次，二甲双胍处理导致ROS水平显著降低，同时抗氧化酶基因表达稳定，表明细胞死亡并非由氧化应激过度引起。第三，线粒体跨膜电位显著升高，提示线粒体功能发生改变，这种改变与凋亡发生相关。第四，促凋亡基因pca1、aif1和rad9未参与二甲双胍诱导的凋亡，而cnx1基因表达显著上调，提示其可能在二甲双胍诱导的凋亡中发挥重要作用。
本研究的结论指出，二甲双胍在粟酒裂殖酵母中诱导的细胞死亡主要通过凋亡途径介导，且该过程伴随线粒体跨膜电位的升高和ROS水平的降低，说明二甲双胍具有双重调节效应。研究首次在粟酒裂殖酵母中明确了cnx1基因在二甲双胍诱导凋亡中的潜在作用，为理解二甲双胍的细胞毒性机制提供了新的视角。此外，该研究验证了粟酒裂殖酵母作为药物筛选模型的可行性，为后续深入研究二甲双胍在癌症治疗和抗衰老中的作用机制奠定了基础。
本研究的亮点包括：首次系统性地在粟酒裂殖酵母中探讨了二甲双胍诱导的细胞死亡机制；发现二甲双胍降低ROS水平但升高线粒体跨膜电位的独特现象，揭示了其双重调节特性；明确了cnx1基因在二甲双胍诱导凋亡中的潜在关键作用；以及通过突变菌株排除了pca1、aif1和rad9基因的参与，进一步缩小了凋亡调控基因的范围。此外，该研究由土耳其科学技术研究理事会（TUBİTAK）1002项目（119Z186）资助，并特别感谢B. Palabiyik和E. Yoruk提供的化学试剂和酵母菌株。
总体而言，该研究为二甲双胍在真核细胞中的细胞毒性机制提供了新的实验证据，特别是在线粒体应激和程序性细胞死亡方面的见解，对于理解二甲双胍的多效性药理作用以及开发基于酵母的药物筛选平台具有重要的科学价值和应用前景。