CRISPR Anti-Tag介导的室温RNA检测技术（CARDD）研究进展

作者及发表信息
本研究由Jeong Moon（美国康涅狄格大学健康中心生物医学工程系）、Jiongyu Zhang、Xin Guan等共同完成，合作单位包括韩国顺天乡大学生物制药科学系、赞比亚传染病研究中心等。研究成果于2025年发表于*Nature Communications*（DOI: 10.1038/s41467-025-64205-4）。

学术背景
CRISPR/Cas系统（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关系统）因其高特异性和可编程性成为核酸检测的重要工具。其中，Cas13a（一种RNA引导的核糖核酸酶）因其RNA靶向能力备受关注。然而，传统Cas13a检测技术面临两大挑战：依赖核酸预扩增（如RT-RPA、RT-LAMP）和需高温反应条件（37°C），限制了其在资源有限环境中的应用。
本研究旨在解决上述问题，通过解析Cas13a的变构调控机制，发现靶标RNA的二级结构和反标签序列（anti-tag）可抑制Cas13a的反式切割活性。基于此，团队设计了一种新型“CRISPR反标签发夹结构”（CRISPR anti-tag hairpin），开发出CRISPR Anti-Tag介导的室温RNA检测技术（CARDD），实现无需预扩增、室温条件下的一步式高灵敏度RNA检测。

研究流程与方法
1. Cas13a活性调控机制解析
- 研究对象：靶标RNA（单链/双链结构）、含anti-tag序列的RNA、设计的发夹结构（14d/16d/18d/20d hp）。
- 实验设计：
- 比较不同温度（25°C–37°C）下Cas13a的反式切割效率，发现25°C时活性最高（图2b-c）。
- 验证anti-tag序列（5’-RGRURURURURARGRU-3’）对Cas13a活性的抑制效应（图2d），发现双链RNA（dsRNA）或发夹结构进一步降低活性。
- 设计含不对称DNA/RNA嵌合茎区的发夹结构（图1b），通过PAGE凝胶电泳验证其切割效率（图3d）。

1. CARDD技术开发

   • 核心设计：发夹结构的环区含anti-tag序列，茎区含靶标RNA互补序列。靶标RNA激活Cas13a后，切割发夹环区释放茎区RNA，触发级联信号放大（图1c）。
     
   • 优化参数：
     
     • 筛选DNA阻断序列长度（14–20 bp），14 bp阻断效率最佳（图3c）。
       
     • 确定发夹浓度（HIV检测：5 nM；HCV检测：1 nM）。
       

2. 灵敏度与特异性验证

   • 检测目标：HIV和HCV病毒RNA，浓度梯度（10 aM–1 pM）。
     
   • 结果：
     
     • HIV检测限（LOD）达10 aM，较传统Cas13a方法灵敏度提升10,000倍（图4a）。
       
     • HCV检测同样实现10 aM灵敏度（图4b）。
       
     • 特异性测试显示无交叉反应（图4d）。
       

3. 临床样本验证

   • 样本：30例临床血浆样本（9例HIV阳性，21例阴性）。
     
   • 方法：对比CARDD与RT-qPCR结果，一致性达93.3%（图6b-f）。
     
   • 性能指标：灵敏度77.8%，特异性100%，AUC 0.9709（图6f）。
     

主要结果与逻辑关联
- 温度优化：25°C下Cas13a活性最高，简化设备需求（图2c）。
- anti-tag抑制效应：为设计信号放大发夹提供理论基础（图2d）。
- 级联放大机制：发夹切割后释放的RNA二次激活Cas13a，实现信号指数增长（图3c-d）。
- 临床适用性：低浓度病毒RNA检测与临床样本验证凸显技术实用性（图6）。

结论与价值
1. 科学价值：
- 首次揭示anti-tag序列与RNA二级结构对Cas13a活性的协同抑制机制。
- 提出“变构调控-级联放大”新模型，为CRISPR诊断工具设计提供新范式。

1. 应用价值：
   
   • 无需扩增：避免核酸预扩增的复杂操作与污染风险。
     
   • 室温检测：摆脱温控设备依赖，适用于基层医疗场景。
     
   • 高性价比：单一Cas13a酶实现级联反应，降低成本。
     

研究亮点
1. 创新方法：首创CRISPR反标签发夹结构，实现单酶级联信号放大。
2. 灵敏度突破：10 aM检测限为目前Cas13a直接检测的最高水平。
3. 临床兼容性：在资源有限环境中展示HIV/HCV检测潜力。

局限与展望
- 发夹设计需进一步优化以降低背景噪声。
- 未来可结合纸基检测或便携荧光读值设备，提升现场适用性。

本研究为CRISPR分子诊断开辟了新路径，尤其对传染病即时检测（POCT）具有重要推动作用。