本文献属于类型b：一篇综述性科学论文。
荧光原位杂交信号放大技术的最新进展综述
作者及机构信息： 本文由西南医科大学的凌宇鹏 (Yu-Peng Ling)、李嘉嘉 (Jia-Jia Li)、中国医学科学院的刘家伟 (Jia-Wei Liu)、西南医科大学的曾波 (Bo Zeng)、陈桂兰 (Gui-Lan Chen) 以及通讯作者王娜 (Na Wang) 共同撰写。文章发表于期刊《Gene》的第964卷（2025年），文章编号149647，于2025年6月25日在线发表。
论文主题： 本文是一篇关于荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）领域内信号放大技术创新的综述文章。文章系统回顾了FISH技术的发展历程，详细阐述了其标准实验流程中的关键环节与优化策略，并重点介绍了近年来涌现的几种革命性信号放大技术——RNA Scope、PLISH和SABER——的原理、优势与局限。文章旨在为从事相关研究的科研人员提供一份全面的技术参考和理论指导。
主要观点阐述：
一、 荧光原位杂交（FISH）技术概述及其在低丰度靶标检测中面临的挑战 文章开篇明确了原位杂交（in situ hybridization, ISH）及其荧光形式FISH的基本原理：利用互补碱基配对原则，使用标记的核酸探针在细胞、组织切片乃至三维器官中定位并可视化特定的DNA或RNA序列。FISH技术因其能提供基因表达的空间位置信息，在基础研究和临床诊断（如疾病诊断、细菌检测、基因重排分析）中具有不可替代的价值。然而，文章指出，传统FISH技术的核心局限在于其灵敏度不足，难以有效检测低丰度的核酸靶标。单个荧光探针分子产生的信号强度有限，常常低于成像设备的检测阈值，这严重制约了该技术在研究低表达基因或单分子水平检测中的应用。因此，开发高效的信号放大策略成为推动FISH技术发展的关键。
二、 FISH标准实验流程的优化是成功的基础 文章花费大量篇幅详细梳理了FISH实验的三个核心步骤——组织制备与透化、杂交、以及杂交后处理——并强调了每一步的优化对于获得高信噪比结果的重要性。作者并非简单罗列步骤，而是基于大量文献，提供了深入的原理分析和实用建议。 * 组织制备与透化：这是决定实验成败的第一步。文章比较了冰冻切片和石蜡切片的优缺点，并详细讨论了固定剂的选择（如4%多聚甲醛、10%中性福尔马林）、固定时间和温度的影响。特别指出，过度固定会掩盖抗原表位并影响组织形态，而固定不足则无法有效保存核酸。透化步骤旨在让探针进入细胞，常用去垢剂（如Triton X-100）或蛋白酶（如蛋白酶K）处理。文章强调，蛋白酶处理的强度需根据样本类型和固定条件精细调整，过度消化会导致背景升高和组织结构破坏，而消化不足则影响探针穿透。作者还提及了针对革兰氏阳性菌等特殊样本的透化策略，以及实时评估酶消化程度的新方法。 * 杂交：此步骤的核心是创造最佳的杂交环境，确保探针与靶序列特异、完全地结合。文章分析了杂交缓冲液中各组分的作用：甲酰胺用于降低杂交所需温度，保护组织形态；牛血清蛋白（BSA）用于封闭非特异性结合位点；盐离子浓度（如SSC）和pH值对杂交特异性至关重要。作者指出，杂交温度和时间需要根据探针长度、GC含量以及样本特性进行优化，并总结了成功杂交的四个要素：足够的组织穿透、良好的探针特异性、探针与靶标的低降解率，以及针对样本的杂交条件优化。 * 杂交后处理：杂交后的洗涤旨在去除未结合的游离探针，降低背景噪音。文章提到，洗涤液通常含有甲酰胺和SSC。此外，样本的自发荧光是干扰信号解读的重要因素。作者列举了多种降低自发荧光的方法，包括硼氢化钠处理消除希夫碱、光谱拆分、高强度光照漂白以及苏丹黑B预处理。还特别指出，乙酰化处理可以中和酶处理暴露出的带正电蛋白和氨基基团，从而有效降低由静电相互作用引起的背景信号。
三、 酪酰胺信号放大FISH（TSA-FISH）通过酶促沉积实现信号级联放大 作为较早发展的信号放大技术，TSA-FISH的原理基于酪酰胺信号放大（Tyramide Signal Amplification, TSA）。其过程是：首先，探针（或通过抗体间接标记）与靶标结合，并连接辣根过氧化物酶（HRP）。在过氧化氢存在下，HRP催化荧光或生物素标记的酪酰胺底物，产生大量活性自由基，这些自由基瞬间沉积在HRP附近的蛋白质酪氨酸残基上，实现信号的极大增强。文章指出，单个HRP分子可催化沉积大量酪酰胺分子，使得TSA-FISH能够检测单拷贝基因或低丰度RNA。此外，通过热或微波处理洗脱抗体而保留共价结合的荧光团，可以实现多轮标记，从而在单一样本上实现多达6-8种靶标的共定位，获得更丰富的生物学信息。然而，TSA-FISH也存在局限：HRP标记的探针分子量较大（约40 kDa），难以穿透固定后的细胞，因此需要对透化方案进行特别优化；此外，样本内源性过氧化物酶若未完全灭活，可能导致假阳性信号。
四、 RNA Scope技术通过“双Z”探针设计实现高特异性靶向与信号级联 RNA Scope是一种专为检测低丰度RNA而设计的新型ISH技术，其核心在于独特的“双Z”探针设计。每对“双Z”探针由两个独立的探针组成，它们必须同时、连续地结合到靶RNA上相邻的约50个碱基区域，才能形成稳定的杂交结构。只有当这对探针成功结合后，它们尾部的序列才能共同作为一个结合位点，与预扩增子（Preamplifier）结合。预扩增子再结合多个放大器（Amplifier），每个放大器又可结合多个标记探针（Label Probe），从而将单个靶RNA分子的信号放大数个数量级。文章强调，这种设计确保了极高的特异性，因为非靶标RNA极不可能同时满足两个独立探针的精确结合条件，从而显著提高了信噪比，并能实现单分子RNA的可视化。其优势包括操作相对简单、信号强、背景低。但缺点也明显：其“双Z”探针是ACD公司的专利设计，需购买配套试剂，成本较高；此外，实验过程中需要对样本进行75°C的高温变性处理，可能对组织蛋白和结构造成影响。
五、 邻近连接原位杂交（PLISH）利用霍利迪连接与滚环放大实现单分子检测 PLISH是一种基于邻近连接原理的多重ISH技术。它使用一对DNA杂交探针（H探针），分别识别靶RNA转录本上相邻的序列。每个H探针除了与靶RNA互补的区域外，还带有一个单链悬垂末端。当两个H探针通过靶RNA在空间上接近时，它们与一个可变桥接（VB）寡核苷酸和一个通用连接环（CCC2.1）寡核苷酸共同形成一个稳定的霍利迪连接结构。随后，VB和CCC2.1被催化连接成一个闭合环，作为滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）的模板进行信号放大。标记了荧光团的VB寡核苷酸作为标记探针，确保荧光信号定位于靶转录本位置。文章指出，PLISH的优势在于其强大的信号放大能力（可达1000倍）、技术相对简单、成本较低，且无需特殊设备。它能在完整的细胞和组织中灵敏、定量地定位单个RNA分子，并可与免疫染色结合。其高强度的点状信号易于与背景噪音区分。PLISH适用于在完整组织中进行单细胞转录谱分析，并整合细胞形态学特征。
六、 信号交换反应放大（SABER）通过引物交换反应生成长串联体实现灵活的多重检测 SABER技术通过赋予FISH探针长的单链DNA（ssDNA）串联体来实现信号放大。其核心技术是引物交换反应（Primer Exchange Reaction, PER），该反应利用催化发夹和链置换聚合酶，从一个短DNA引物开始，反复添加相同的序列单元，从而在体外合成出长度可控的长ssDNA串联体。这些串联体作为探针的延伸部分，通过杂交与靶标结合后，再与携带荧光团的次级“成像”探针杂交，实现信号增强（可达5-450倍）。SABER的一个关键创新是其模块化和可重置性：通过使用“桥连”序列，可以将较短的靶标结合探针与PER串联体连接起来；更重要的是，成像探针可以从其串联体上剥离，从而“重置”该荧光通道，以便在后续成像轮次中用于标记不同的靶标。这种特性使得SABER能够实现高度多重（Multiplex）的连续检测。文章指出，SABER应用广泛，不仅可用于RNA和DNA（内源或外源），还可通过DNA偶联抗体检测蛋白质靶标。
七、 新兴技术与未来展望 文章在讨论部分简要提及了基于CRISPR技术的最新进展，即CRISPR介导的荧光原位杂交放大器（CRISPR FISHER）系统。该系统利用CRISPR-Cas系统的靶向性和相分离技术，在活细胞中实现了染色体上单拷贝及多拷贝基因的高灵敏度成像。这代表了FISH技术向活细胞、动态检测方向的发展。然而，作者也指出该技术目前仍需将多个元件转染进细胞，可能改变细胞原有生理特性，且对于厚组织的检测在成像技术等方面仍需改进。
论文的意义与价值： 本综述系统性地总结了FISH技术，特别是其信号放大策略的发展脉络与最新进展。它不仅为研究人员，尤其是初学者，提供了从样本处理到结果优化的详尽实验指南，更重要的是，它深入剖析并比较了RNA Scope、PLISH和SABER这三种前沿放大技术的原理、性能（通过文中的表格对比了探针类型、特异性、信号放大效率、成本、操作难度等）及应用场景。文章明确指出，这些技术创新通过提高探针结合特异性和设计高效的信号放大器，极大地提升了FISH检测低丰度靶标的能力和多重检测的灵活性，突破了传统技术的瓶颈。因此，本文对于从事分子细胞生物学、病理学、发育生物学及临床诊断等领域的研究人员具有重要的参考价值，能够帮助他们根据具体的研究需求和条件（如靶标丰度、多重检测要求、预算、技术平台）选择最合适的FISH策略，并为该领域的未来技术发展提供了清晰的理论框架和发展方向展望。