本研究由Qingyu Zhang（山东第一医科大学附属山东省立医院骨科）、Tengqi Li（北京大学中日友好临床医学院骨科）、Zirong Li（中日友好医院骨科中心）、Jike Lu（北京和睦家医院骨科）、Xinjie Wu（北京大学中日友好临床医学院骨科）、Fuqiang Gao（中日友好医院骨科中心）和Wei Sun（中日友好医院骨科中心）共同完成，发表于Cells期刊2022年6月14日第11卷第12期。

学术背景

该研究属于骨微血管生物学与药物干预交叉领域。糖皮质激素（glucocorticoids, GCs）是临床上广泛使用的抗炎免疫抑制剂，但其长期使用会导致股骨头骨坏死（osteonecrosis of the femoral head, ONFH）和继发性骨质疏松。研究发现，GCs通过诱导骨微血管内皮细胞（bone microvascular endothelial cells, BMECs）损伤和凋亡，破坏骨骼微循环，进而引发骨疾病。淫羊藿苷（icariin, ICA）是从传统中药淫羊藿中提取的活性成分，具有明确的骨保护作用，但其是否通过细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的自分泌活性发挥保护机制尚不明确。本研究旨在揭示ICA通过调控BMECs来源EVs的生物学特性，改善GCs诱导的BMECs损伤的作用机制。

研究流程

1. BMECs分离与鉴定

从18例接受全髋关节置换术患者的股骨头中分离正常松质骨（样本量：6例原发性骨关节炎、6例发育性髋关节不良继发骨关节炎、6例股骨颈骨折）。通过胶原酶-胰蛋白酶消化结合CD31磁珠分选法获取BMECs，经免疫荧光检测vWF和CD31阳性表达确认纯度。透射电镜显示细胞具有典型的微绒毛结构和Weibel-Palade小体。

2. ICA浓度优化

采用CCK-8法检测不同浓度ICA（0-1×10⁻⁴ M）对BMECs增殖的影响。结果显示5×10⁻⁵ M ICA可使细胞增殖率显著提高29.86%（p<0.01），确定为后续实验浓度。

3. EVs分离与表征

超速离心法分离BMECs分泌的EVs，通过： - 纳米颗粒追踪分析（NTA）：显示ICA处理组EVs平均直径85.35±1.65 nm，与对照组（86.68±1.97 nm）无显著差异 - 透射电镜：观察到典型球形结构 - Western blot：检测到EVs标志蛋白CD9和CD81高表达 - BCA法：两组EVs总蛋白量无统计学差异（132.63±3.33 vs 138.56±9.58 μg/ml）

4. EVs内容物分析

• 蛋白质组：抗体芯片检测发现ICA组EVs中VEGF和TGF-β1表达显著升高（p<0.01）
• miRNA测序：鉴定出50个差异表达miRNA（30个上调如hsa-mir-1469，20个下调如hsa-mir-133a-5p）。qPCR验证hsa-mir-133a-5p和hsa-mir-10b-5p显著下调，hsa-mir-1469上调（p<0.01）
• 炎症因子阵列：发现29个差异表达蛋白（25个上调如EMMPRIN、Galectin-3，4个下调）

5. 功能验证实验

• 细胞迁移：划痕实验显示ICA-BMEC-EVs组24小时迁移率显著高于模型组（p<0.01）
• 血管生成：Matrigel成管实验表明ICA组分支点和管长度增加（p<0.05）
• 细胞凋亡：流式细胞术显示ICA组凋亡率降低70%（10.70±0.7% vs 模型组35.67±1.99%）
• 细胞活力：CCK-8检测证实ICA组OD值随时间持续升高（p<0.01）

主要结果

1. EVs表征：ICA不改变EVs粒径但提高分泌量（1.54×10⁷/ml vs 对照组9.85×10⁶/ml）
2. 关键分子变化：
   • 促血管因子VEGF和TGF-β1表达上调
   • 凋亡相关miRNA（hsa-mir-10b-5p）显著下调
   • 炎症网络分析发现ICAM1、MMP3、LGALS3等9个核心蛋白
3. 功能改善：EVs自分泌可增强细胞迁移（迁移率提高2.3倍）、血管生成（分支点增加1.8倍）并抑制凋亡（凋亡率降低70%）

结论与价值

本研究首次揭示： 1. 科学价值：阐明ICA通过调控EVs携带的VEGF/TGF-β1-miRNA网络改善BMECs功能的分子机制，为GCs骨损伤提供新的治疗靶点。 2. 应用价值：证实EVs自分泌是中药活性成分发挥作用的重要途径，为开发基于EVs的骨坏死治疗策略提供实验依据。 3. 临床意义：5×10⁻⁵ M ICA可作为优化给药浓度，其通过EVs介导的远端效应可能减少全身给药副作用。

研究亮点

1. 技术创新：结合NTA、高通量miRNA测序和蛋白芯片多组学分析EVs内容物
2. 模型特色：采用临床患者来源的原代BMECs，更贴近病理生理状态
3. 机制创新：发现ICAM1-MMP3-LGALS3信号轴是ICA调控的关键网络
4. 转化潜力：鉴定出hsa-mir-133a-5p等可作为治疗监测的生物标志物

局限与展望

作者指出需进一步开展：①动物实验验证EVs的体内归巢效应；②探索EVs与其他骨细胞的旁分泌作用；③开发基于关键miRNA的靶向递送系统。这些发现为中医药现代化研究提供了典型范例。