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本研究的主要作者为Yunhua Fu、Xuan Hu、Dongyue Zhou、Xue Li、Xingyu Tao、Di Yang、Fei Zheng、Yulin Dai和Hao Yue，他们均来自长春中医药大学人参研究院。该研究于2022年5月20日发表在期刊《Separations》上，主题为“Viscozyme辅助提取的马齿苋多糖对H2O2处理的MC3T3-E1细胞和斑马鱼的抗骨质疏松作用”（Anti-Osteoporotic Effect of Viscozyme-Assisted Polysaccharide Extracts from Portulaca Oleracea L. on H2O2-Treated MC3T3-E1 Cells and Zebrafish）。本研究旨在筛选和表征马齿苋多糖（POPs）对H2O2诱导的成骨细胞凋亡的保护作用，并通过体外和体内实验探索其潜在的抗骨质疏松机制。

学术背景

骨质疏松症（Osteoporosis, OP）是一种以骨量减少、骨微结构破坏和骨脆性增加为特征的全身性代谢疾病。其发病机制与氧化应激密切相关，而H2O2作为一种常见的氧化剂，能够诱导成骨细胞凋亡，从而加剧骨质疏松的病理过程。近年来，天然产物的提取物因其抗氧化活性被广泛研究用于预防和治疗骨质疏松。马齿苋（Portulaca Oleracea L., POL）是一种分布广泛且具有多种生物活性的植物，其多糖成分被认为具有潜在的抗氧化和抗骨质疏松作用。然而，马齿苋多糖的提取效率较低，且其抗骨质疏松机制尚未完全阐明。因此，本研究采用酶辅助提取技术，筛选出具有高抗氧化活性的多糖组分，并探讨其在H2O2诱导的氧化应激中的保护作用。

研究流程

本研究分为以下几个主要步骤： 1. 多糖提取与分离：采用Viscozyme、Celluclast、α-淀粉酶和β-葡聚糖酶四种酶辅助提取马齿苋多糖。通过梯度乙醇沉淀法得到不同分子量的多糖组分，分别为POP1、POP2、POP3和POP4。提取的多糖经过Sevag试剂脱蛋白处理，并最终通过高效液相色谱-凝胶渗透色谱（HPLC-GPC）测定其分子量。 2. 细胞实验：使用MC3T3-E1小鼠成骨细胞系作为研究对象，通过MTT法检测细胞存活率，确定H2O2的建模浓度。采用Hoechst 33342和吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色观察细胞凋亡形态，并通过流式细胞术定量分析细胞凋亡率。此外，通过Western blot检测核因子E2相关因子2（Nrf2）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）、血红素加氧酶-1（HO-1）和NADPH醌氧化还原酶1（NQO1）的表达水平。 3. 斑马鱼实验：使用斑马鱼作为体内模型，检测H2O2诱导的活性氧（ROS）生成和脂质过氧化水平。通过荧光染色观察斑马鱼胚胎的骨结构，并采用Western blot分析Keap1、HO-1和NQO1在斑马鱼组织中的表达。 4. 化学成分分析：通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化法和HPLC分析马齿苋多糖的单糖组成。

主要结果

1. 多糖提取与抗氧化活性筛选：Viscozyme辅助提取的多糖组分（VPOP1）显示出最高的抗氧化活性，且在梯度乙醇沉淀中，30%乙醇沉淀的VPOP1得率最高。
2. 细胞实验：VPOP1显著抑制H2O2诱导的MC3T3细胞凋亡，且呈剂量依赖性。VPOP1处理显著提高了HO-1和NQO1的表达水平，同时降低了Nrf2和Keap1的表达。
3. 斑马鱼实验：VPOP1显著降低了H2O2诱导的斑马鱼胚胎中的ROS生成和脂质过氧化水平，并促进了斑马鱼胚胎的骨生长。Western blot结果显示，VPOP1处理显著上调了Keap1的表达，同时下调了HO-1和NQO1的表达。
4. 化学成分分析：VPOP1被鉴定为一种酸性杂多糖，其分子量约为7.6 kDa，主要包含甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖。

结论

本研究通过酶辅助提取技术成功筛选出具有强抗骨质疏松活性的马齿苋多糖组分VPOP1。VPOP1通过调控Nrf2-Keap1信号通路，显著抑制了H2O2诱导的氧化应激和成骨细胞凋亡。此外，VPOP1在斑马鱼体内也表现出显著的抗氧化和促骨生长作用。研究结果表明，VPOP1作为一种低分子量多糖，具有开发为抗骨质疏松功能性食品的潜力。

研究亮点

1. 创新性提取方法：本研究采用酶辅助提取技术，显著提高了马齿苋多糖的提取效率和抗氧化活性。
2. 多模型验证：通过体外细胞实验和体内斑马鱼模型，全面验证了VPOP1的抗骨质疏松作用。
3. 机制探索：首次阐明了VPOP1通过Nrf2-Keap1信号通路发挥抗氧化和抗凋亡作用的分子机制。
4. 潜在应用价值：VPOP1作为一种天然抗氧化剂，具有开发为功能性食品或药物的潜力，为骨质疏松的预防和治疗提供了新的思路。

其他有价值的内容

本研究还探讨了马齿苋多糖的化学成分及其与抗氧化活性的关系，为未来进一步优化多糖提取工艺和开发新型抗氧化剂提供了重要参考。此外，研究中所采用的梯度乙醇沉淀法和HPLC-GPC分析技术也为多糖的分离和表征提供了可靠的方法学支持。