关于新生儿大规模基因组筛查可行性与临床意义的前瞻性队列研究报告
本研究由意大利都灵大学、都灵健康与科学城医院、Regina Margherita儿童医院及意大利基因组医学研究所等机构的研究人员合作完成。主要作者包括Diana Carli博士、Paola Quarello博士、Francesco Porta博士等，通讯作者为Paola Quarello博士。该研究于2025年10月17日发表于《JAMA Network Open》期刊（卷8，期10，文章编号e2538198）。
一、 研究背景与目的
本研究属于儿科、医学遗传学及公共卫生领域，聚焦于新生儿筛查（Newborn Screening, NBS）技术的革新。自20世纪60年代基于干血斑（Dried Blood Spot, DBS）的苯丙酮尿症筛查开启NBS时代，到90年代串联质谱技术的应用，NBS已成功预防了许多先天性疾病的严重后果。然而，传统生化筛查仅能检测已有代谢物或激素异常的疾病，无法识别在出生时无生化标志物但具有明确致病基因变异、且儿童期可干预的遗传病。下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术，特别是全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES），为同时检测数百种单基因遗传病提供了可能，有望将NBS从生化异常检测推向基因组时代。
尽管已有一些探索性研究，但将基因组测序大规模整合到常规NBS项目中仍面临诸多挑战，包括技术可行性（如从DBS中提取高质量DNA进行测序）、结果解读的复杂性、临床效用不明确以及相关的伦理问题。因此，本研究旨在通过一项名为“NeoGen”的前瞻性队列研究，系统评估基于DBS的WES在大规模新生儿群体中应用的可接受性和技术可行性，并初步探索其临床意义。具体目标包括：1) 评估使用DBS进行WES的技术成功率；2) 建立基因组数据库以便后续基于临床指征进行快速重分析；3) 通过具体案例初步评估基因组NBS结果对患儿及家庭的临床影响，为未来常规应用提供依据。
二、 研究设计与详细流程
本研究为一项前瞻性、非药物干预性、单中心队列研究。研究在意大利都灵的Sant’Anna医院（一家三级转诊中心）开展，招募期为2023年10月1日至2024年7月31日。研究流程包含多个严谨步骤：
1. 研究对象招募与样本采集： 研究向在此期间分娩的所有符合条件的新生儿父母提出参与邀请。最终，在4709名符合条件的新生儿中，有4067名（86.4%）被成功纳入研究，参与者父母签署了知情同意书。未参与的主要原因是语言障碍和对临床研究的不信任。研究收集了新生儿的人口学与围产期特征（见表1），其中男性占51.1%，平均胎龄38.7周，绝大多数（86.8%）为欧洲裔。在出生后第3天，除常规NBS所需的Guthrie卡外，为每名新生儿额外采集一张DBS卡，风干24小时后用于研究。
2. 基因面板选择： 研究未进行全基因组或全外显子组的无偏倚报告，而是采用了一种聚焦于“可干预”疾病的靶向分析策略。由一个多学科委员会（包括实验室和临床遗传学家、罕见病儿科亚专科专家、临床心理学家）精心筛选了一个包含521个基因的列表，这些基因与517种儿童期或儿童-成年期发病、且有有效治疗或预防策略的疾病相关。覆盖的疾病类别广泛，包括先天性代谢缺陷（131个基因）、内分泌疾病（104）、听力损失（83）、免疫缺陷（67）、血液疾病（44）、心血管疾病（30）、神经肌肉疾病（23）等。明确排除了仅与成人期发病相关的基因（如BRCA1/2杂合子）。
3. 实验室测序与数据分析流程： * DNA提取与质控： 从每份DBS上取3个0.4毫米直径的圆片进行DNA提取。对于浓度低于3 ng/μL的样本，进行重新提取和浓缩，确保了低起始量样本的成功处理。 * 文库构建与测序： 使用Illumina DNA Prep with Exome 2.5 Enrichment Kit进行文库制备和外显子组捕获（靶区大小37.5 Mb）。随后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双末端150 bp测序。测序数据与GRCh37/hg19参考基因组进行比对。 * 数据质量： 平均靶向覆盖深度约为120倍，98.0%和97.5%的靶区分别达到了至少10倍和20倍的覆盖，保证了变异检测的可靠性。 * 变异检测与注释： 使用公共基因突变数据库（如ClinVar、dbSNP）、人群频率数据库（如gnomAD）以及多种计算机预测工具（包括AlphaMissense、CADD、REVEL、SpliceAI等）进行变异注释和初步筛选。
4. 变异解读与确认流程（关键创新点）： 这是研究的核心环节，旨在平衡检测灵敏度与特异性，特别是在无症状新生儿中减少假阳性。流程严格遵循美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，但进行了针对性优化： * 严格化标准： 为避免在无症状个体中过度解读，对某些ACMG证据项的组合应用进行了限制。例如，若一个变异仅依赖于人群频率低（PM2）和计算机预测有害（PP3）两项证据，则仅当AlphaMissense也预测其为有害时，才被考虑为致病/可能致病（Pathogenic/Likely Pathogenic, P/LP）变异。 * 报告范围： 仅报告在521基因面板内、且符合疾病遗传模式（如显性遗传为杂合，隐性遗传为纯合或复合杂合）的P/LP变异。对于常染色体隐性遗传病，仅报告患者状态，不常规报告携带者状态（X连锁隐性遗传的女性携带者等特殊情况除外）。拷贝数变异（CNV）也仅当涉及面板基因且被分类为P/LP时才报告。 * 正交确认： 所有初步筛查出的P/LP变异，均需通过独立方法进行验证。单核苷酸变异和小片段插入缺失使用Sanger测序验证；单外显子CNV使用多重连接依赖性探针扩增技术验证；更大片段CNV或染色体异常使用染色体微阵列分析或核型分析验证。 * 家系共分离分析： 在可能的情况下，采集父母样本进行家系分析，以明确变异的遗传来源（新发或遗传性）及相位（顺式/反式），这对于复合杂合变异的解读至关重要。
5. 结果返回与临床随访： 筛查结果为阳性的新生儿被召回，由一个多学科团队（包括心理学家、儿科遗传学家、专科医生）进行评估。进行临床评估和必要的二级检查。结果在检测后遗传咨询中告知家庭，并为先证者及合适的家庭成员制定随访计划。
6. 数据存储与重分析： 所有WES数据被安全存储，保留4年。在研究随访期间，若有新生儿出现疑似遗传病的临床症状，无论其初始筛查结果如何，都可利用已存储的WES数据进行快速重分析（通常作为单例分析），以寻找初始面板之外的可能致病原因。
三、 主要研究结果
1. 技术可行性结果： 在4067名纳入的新生儿中，有4054名（99.7%）成功完成了WES测序。失败案例主要源于最初的DNA提取失败（53例），其中13个家庭拒绝再次采样，其余40例经重新采样后成功。另有19例测序失败，经重新采样后全部成功分析。总体筛查失败率仅为0.3%。从获得同意到出具报告的中位周转时间为32天（范围15-97天）。这充分证明了使用DBS进行大规模新生儿WES筛查在技术上是高度可行的，成功率极高。
2. 筛查阳性率与分子诊断结果： 在4054名成功分析的新生儿中，共有542名（13.4%）初筛阳性。经过正交确认和家系分析后，排除了18个假阳性诊断（其中13个源于技术未确认，5个源于生化检测排除），最终保留了568个潜在分子诊断，分布于529名新生儿中，占分析总人数的13.0%。这意味着超过十分之一的新生儿被检测出至少一种与可干预遗传病相关的P/LP变异。 这些诊断按表型大类分布如下：心脏病学相关（179例，如心肌病、心律失常）、血液学/免疫学相关（147例，其中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症占123例）、内分泌学相关（92例，如青春期障碍、胆固醇代谢异常）及其他（163例，包括听力损失、代谢病、大片段CNV等）。
3. 结果分类与临床确认： 在最终保留的568个诊断中，研究者根据现有信息进行了分类： * 真阳性诊断（96例，占16.9%）： 在新生儿和/或患病父母中得到了临床和/或生化检查的确认。 * 假阳性诊断（18例，占3.1%）： 已被技术或生化证据排除。 * 可能诊断（467例，占82.2%）： 这是基因组筛查面临的主要挑战。这些诊断涉及的疾病具有可变外显率、不完全外显率或与年龄/性别相关的表现。仅凭一次正常的临床评估无法排除未来发病的可能。例如，携带某些心肌病基因P/LP变异的新生儿在婴儿期可能完全无症状。值得注意的是，其中有31例患儿的家族史提示了所怀疑的疾病。这些“可能诊断”需要长期的临床随访来明确其最终意义。
4. 与生化NBS的对比： 研究将基因组筛查结果与传统生化NBS进行了比较。在两种筛查均覆盖的疾病中，仅发现2例结果一致（1例原发性肉碱缺乏症，1例CblC型甲基丙二酸血症）。有3例基因组筛查提示可能为部分生物素酶缺乏症，但生化NBS及召回后的酶活性检测均为正常，从而排除了诊断。这凸显了两种方法的互补性：生化NBS检测功能异常，而基因组NBS检测遗传风险。
5. 临床案例展示： 研究列举了几个典型案例来说明基因组筛查带来的不同临床场景： * 双重诊断： 一名新生儿同时被检出戈谢病（GBA基因）和Usher综合征（USH2A基因）的复合杂合致病变异。前者可通过酶学确认并计划在症状出现时开始酶替代治疗；后者（迟发性听力损失伴视网膜色素变性）则需进行长期听力监测。 * 家族性疾病的发现： 在无症状新生儿中检出致病变异，从而发现其父母一方未确诊的疾病（如致心律失常性右心室心肌病、扩张型心肌病），实现了家族风险预警。 * 快速确诊危重病例： 一名出生时即出现严重心律失常的新生儿，通过基因组筛查迅速发现了KCNH2基因的新发致病变异，确诊为长QT综合征，指导了及时的抗心律失常治疗、起搏器植入等干预。 * 复杂表型的解释： 一名已知有神经纤维瘤病1型（NF1基因）家族史的新生儿，额外检出SYT2基因致病变异，解释了其母亲未被诊断的轻度神经肌肉症状及新生儿自身的严重临床表现，并由此开始了靶向药物治疗。
6. WES数据重分析的价值： 在随访期间，有45名新生儿因出现疑似遗传病的临床症状而接受了基于已存储WES数据的重分析。其中，9名（20.0%） 获得了明确诊断，而这些诊断所涉及的基因均不在初始的521个筛查面板之内（例如，Snyders Blok-Campeau综合征、Stickler综合征、Noonan综合征等）。这证明了在新生儿期进行基因组测序并存储数据，可为后续儿童期出现的遗传病提供快速、低成本的诊断途径，避免了重复检测和诊断延误。
四、 研究结论与意义
本研究得出结论：基于DBS的WES用于大规模新生儿基因组筛查在技术上是可行的，能够早期识别传统方法无法检测的可干预遗传病。研究发现，在未加选择的新生儿群体中，有13.0%携带至少一个与儿童期可干预疾病相关的P/LP变异，这一比例显著高于传统生化筛查的阳性率。
研究的科学价值与应用价值在于： 1. 提供了大规模实践证据： 以前瞻性队列研究的形式，在真实临床场景中验证了基因组NBS的技术流程、可接受度（高参与率）和产出。 2. 揭示了基因组筛查的复杂性： 研究结果清晰展示了基因组筛查的主要产出并非简单的“是/否”诊断，而大量是“可能诊断”，这凸显了不完全外显率和可变表达度是临床应用面临的核心挑战。这要求配套的遗传咨询必须能够处理不确定性，并建立长期的随访机制。 3. 阐明了互补而非替代的关系： 研究强调，基因组筛查不太可能成为独立的一线检测方法。它应与生化NBS结合使用，前者用于确认和拓展诊断，后者能检测未知遗传基础的疾病及功能异常。基因组筛查的周转时间（中位32天）目前也长于生化NBS（通常10天内），限制了其在危重症新生儿中的即时应用。 4. 展示了长期价值： 存储的基因组数据可作为终身健康资源，在儿童出现症状时进行快速、低成本的重分析，实现“一次检测，终身受益”的潜力。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究也坦诚指出了其局限性：1) 521基因面板虽广，但仍可能遗漏重要基因；使用hg19参考基因组可能影响部分变异检测。2) 靶向WES对复杂结构变异检测能力有限。3) 变异解读仍有挑战，可能存在假阳性或意义未明变异。4) 缺乏长期随访数据，无法评估对不完全外显疾病进行筛查的最终利弊。5) 单中心研究和以欧洲裔为主的人群限制了结果对其他族裔的普适性。
NeoGen研究为将基因组学整合到公共卫生新生儿筛查项目提供了关键的现实世界数据。它证实了技术可行性，量化了潜在产出，并深刻揭示了随之而来的临床、伦理和物流挑战。研究表明，迈向基因组NBS是合乎逻辑的下一步，但必须辅以充分的遗传咨询、清晰的沟通策略以及应对不确定性的长期随访体系。