本研究报告介绍了南京大学化学化工学院配位化学国家重点实验室的黄善清（Shanqing Huang）、陈浩（Hao Chen）等人于2020年在期刊 Analyst 上发表的一项关于简化重组蛋白纯化方法的研究。该研究建立了一种利用镍离子（Ni²⁺）辅助切割，从大肠杆菌（*Escherichia coli*）细胞表面直接释放目标蛋白的一步纯化方法，无需细胞破碎和色谱分离，即可获得高纯度、高产量且具有生物活性的重组蛋白。
重组蛋白表达与纯化是生物化学和生物技术领域的基础环节。传统的大肠杆菌表达系统通常将重组蛋白表达在细胞质中，后续需要经过细胞破碎、离心以及多种色谱分离步骤，操作繁琐、耗时且成本高。为了绕过这些缺点，已有方法尝试将蛋白质分泌到周质空间或直接分泌到培养基中，但成功案例有限，且从周质中提取蛋白仍需要细胞破碎和色谱分离。近年来，一种序列特异性的镍辅助切割标签（sequence-specific nickel-assisted cleavage tag，SNAC-tag，序列为-GSHHW-）被报道，其切割效率高且条件生物相容性好。与传统使用蛋白酶去除亲和标签的方法不同，SNAC-tag 经 Ni²⁺切割后无需从目标蛋白中再去除 Ni²⁺，这为蛋白质纯化提供了新的可能。与此同时，细菌表面展示策略可将重组蛋白锚定在大肠杆菌外膜上，从而避免了胞内蛋白提取的复杂步骤。本研究将表面展示策略与化学切割策略结合，设计了一种新型标签——LOS 标签（LOS tag），用于将目标蛋白展示于细胞表面并实现一步法纯化。
研究工作的核心流程分为以下几个阶段。首先，作者构建了 LOS 标签，该标签包含 Lpp-OmpA 表面锚定蛋白和 SNAC-tag。Lpp 是大肠杆菌脂蛋白的氨基酸 1-9 片段，OmpA 是外膜蛋白的氨基酸 46-159 片段，二者组成的 Lpp-OmpA 被用作锚定蛋白，负责将融合蛋白定位到大肠杆菌外膜。SNAC-tag 位于 Lpp-OmpA 的 C 端，再与目标蛋白融合。为验证该策略的可行性，作者选择了链球菌蛋白 G 的 B1 结构域（GB1）作为模型蛋白，因为该蛋白溶解性好且稳定。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析显示，LOS-GB1 融合蛋白主要存在于膜提取物中，而带有 6His 标签的对照蛋白 6His-GB1 主要存在于细胞质提取物中，证明 LOS 标签成功将 GB1 展示于细胞表面。
在纯化效率测试中，作者将表达 LOS-GB1 的收获细胞重悬于切割缓冲液（0.1 M CHES，pH 8.6，0.1 M 丙酮肟，0.1 M NaCl，1 mM Ni²⁺）中，25 °C 孵育 18 小时后，超过 80% 的 LOS-GB1 融合蛋白被切割，目标蛋白 GB1 通过离心即可以超过 95% 的纯度获得。对照实验显示，表达 6His-GB1 的细胞因缺少表面锚定蛋白，无法被 Ni²⁺切割。产量方面，本研究方法获得的 GB1 产量为约 99 ± 2.5 mg/L，而金属亲和色谱纯化的 6His-GB1 产量仅为 14 ± 0.4 mg/L，前者产量提高了约 7 倍。MALDI-TOF 质谱分析证实 Ni²⁺在 SNAC-tag 的丝氨酸残基前发生切割。为了便于后续应用，可通过脱盐柱或浓缩梯度离心去除切割缓冲液中的 Ni²⁺和其他化学物质。
为了验证该方法对具有生物活性的蛋白质同样有效，并实现切割过程的可视化，作者进一步选择超折叠绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein，sfGFP）作为第二个模型蛋白。表达 LOS-sfGFP 的细胞在切割缓冲液中孵育后，离心后上清液呈现肉眼可见的绿色，而对照 6His-sfGFP 的上清液澄清，说明没有 LOS 标签的融合蛋白不能被 Ni²⁺从外膜上切下。流式细胞术分析显示，LOS-sfGFP 细胞在 Ni²⁺切割后荧光信号明显下降，而 6His-sfGFP 细胞处理前后荧光几乎没有变化。共聚焦显微镜图像进一步揭示，6His-sfGFP 细胞的绿色荧光在切割前后没有变化，而 LOS-sfGFP 细胞在切割后绿色荧光从细胞表面转移到溶液中，这说明 sfGFP 被 LOS 标签有效锚定在细胞表面，并被 Ni²⁺成功释放。SDS-PAGE 显示超过 90% 的 LOS-sfGFP 被切割，上清液中 sfGFP 纯度超过 95%，且通过本方法得到的 sfGFP 纯度高于亲和色谱纯化的 6His-sfGFP（后者纯度约为 80%）。产量方面，sfGFP 的产量为 225 ± 5.8 mg/L，约为 6His-sfGFP 产量（96 ± 3.8 mg/L）的 2.5 倍。
生物活性对比实验通过总发光光谱、绝对量子效率和荧光寿命三个参数进行。结果表明，本方法纯化的 sfGFP 与 6His-sfGFP 在总发光光谱上无差异，绝对量子效率分别约为 28% 和 29%，荧光寿命分别为 3.0 ns 和 2.9 ns，说明本纯化方法不会损失目标蛋白的生物活性。这些结果证明了利用 SNAC-tag 从细胞表面化学切割纯化重组蛋白的可行性。
在操作条件优化方面，作者考察了 pH、盐浓度、Ni²⁺浓度、还原剂、缓冲液种类、孵育温度和细胞密度对切割效率的影响。结果显示，GB1 可在 pH 8.0 至 10.0 范围内被切割，但 pH 10.0 时会有杂质共纯化，可能是高 pH 导致细胞破裂，因此最佳 pH 范围为 8.0 至 9.0。NaCl 浓度（0-0.5 M）对纯化效率无显著影响，说明该方法可适用于多数蛋白质。Ni²⁺浓度在 0.5 至 2 mM 范围内对 GB1 产量和纯度影响不大。0.5 mM TCEP 作为还原剂与该方法兼容，适合需要还原条件的蛋白质。25 °C 下的切割效率高于 4 °C。不同缓冲液测试中，只有 HEPES 的效率与 CHES 相当。细胞密度方面，当 OD600 为 16.0 时，LOS-GB1 的切割效率仅为 60%，而 OD600 在 2.0 至 8.0 范围内切割效率约为 80%。因此，推荐操作条件为：pH 8.0-9.0，0.5-2 mM NiCl₂，0.1 M CHES 或 HEPES 缓冲液，0.1 M 丙酮肟，0-0.5 M NaCl，OD600 为 2.0-8.0，25 °C 孵育 18 小时。
本研究的结论是，作者发展了一种极其简化的蛋白质纯化方法，通过将目标蛋白与包含细胞表面锚定蛋白和化学切割位点的标签融合，实现了目标蛋白在外膜上的锚定和随后从细胞表面的一步释放。该方法能够以高纯度、高产量和完好的生物活性直接从大肠杆菌细胞表面纯化目标蛋白。与传统蛋白质纯化方法相比，该方法无需细胞破碎和色谱分离，具有操作简单和成本低等优点，在工业规模和实验室规模应用中具有巨大潜力。
本研究的亮点在于将细菌表面展示技术与 SNAC-tag 的化学切割策略相结合，开发出一种无需色谱和细胞破碎的重组蛋白纯化新方法。该方法的创新性体现在三个方面：一是利用 LOS 标签将目标蛋白展示于大肠杆菌表面，简化了下游处理步骤；二是利用 Ni²⁺辅助的序列特异性切割释放目标蛋白，避免了蛋白酶切割后需去除蛋白酶的额外步骤；三是纯化过程仅需重悬、孵育和离心即可获得高纯度目标蛋白，显著降低了时间和经济成本。此外，该方法在 GB1 和 sfGFP 两种模型蛋白上均得到了验证，证明了其通用性和实用性，为实验室和工业重组蛋白生产提供了一种有前景的新策略。