近日，一项由 Abena Dwamena 与 Yasin Asadi（共同第一作者）及 Hongmin Wang（通讯作者）等来自美国德克萨斯理工大学健康科学中心药理学与神经科学系、Garrison老龄化研究所和转化神经科学与治疗学中心的研究团队完成的研究，在神经病理学领域的权威期刊 J Neuropathol Exp Neurol 上在线发表，其最终版本于2025年11月1日刊出。该研究题为《小鼠前脑蛋白酶体功能障碍诱导线粒体DNA释放、cGAS-STING信号通路激活和坏死性凋亡》，深入探讨了神经退行性疾病中一个关键的病理机制：蛋白酶体功能障碍如何触发神经炎症和神经元死亡。
学术背景 蛋白酶体是细胞内主要的蛋白质降解系统，负责降解超过80%的胞内蛋白。大量研究表明，在阿尔茨海默病（AD）等多种神经退行性疾病以及衰老过程中，蛋白酶体的功能出现显著障碍。这些疾病通常伴随神经炎症和神经元丢失，但蛋白酶体功能受损如何具体导致这些病理变化，其间的分子机制尚不明确。同时，神经炎症的启动常与胞质内异常存在的DNA被免疫感应有关，其中cGAS-STING信号通路是关键通路。cGAS（环状GMP-AMP合成酶）能感知胞质中的双链DNA（dsDNA），并催化生成第二信使cGAMP，进而激活接头蛋白STING（干扰素基因刺激因子），最终驱动包括NF-κB、TNFα、IL-1β、IL-6等在内的多种促炎因子表达。另一方面，程序性坏死，即坏死性凋亡（necroptosis），是不同于经典凋亡的一种细胞死亡方式，由RIPK1（受体相互作用蛋白激酶1）、RIPK3和MLKL（混合系列激酶结构域样蛋白）介导，具有强烈的促炎特性，也与多种神经退行性疾病相关。基于上述背景，本研究旨在探究神经元特异的蛋白酶体功能障碍是否以及如何通过cGAS-STING通路引发神经炎症，并最终导致坏死性凋亡这一特定形式的神经元死亡。
详细研究流程 本研究采用了一个精心设计的神经元特异性条件性基因敲除小鼠模型作为核心研究对象。研究者将PSMC1基因（26S蛋白酶体19S调节亚基的一个关键成分）两侧带有LoxP位点（”floxed”）的小鼠与表达CaMKIIα启动子驱动的Cre重组酶（T29品系）的小鼠杂交。CaMKIIα启动子主要在前脑神经元中活跃，因此最终获得的PSMC1条件性敲除（cKO）小鼠，其前脑神经元特异性地缺失了PSMC1蛋白，从而破坏了26S蛋白酶体的组装与功能。对照组为同窝出生的不携带Cre的Floxed PSMC1小鼠。所有实验均使用了3月龄的雄性及雌性C57BL/6背景小鼠。
研究流程包含以下几个关键步骤，涵盖了从现象观察到机制探索的完整链条：
敲除模型验证与胞质dsDNA检测：首先，通过蛋白质印迹法确认了cKO小鼠大脑皮层中PSMC1蛋白的表达缺失。随后，研究聚焦于蛋白酶体功能障碍导致的线粒体碎片化可能引发的后果。他们采用免疫荧光技术，对小鼠大脑皮层（背侧额叶皮质）的冰冻切片进行染色。使用的关键抗体是一株特异性识别胞质中松散dsDNA、但不与高度压缩的核DNA结合的抗体，该抗体已报道可特异性标记线粒体来源的DNA（mtDNA）。同时，用抗COX-IV的抗体标记线粒体。通过共聚焦显微镜成像，并使用ImageJ软件量化分析，他们统计了不與線粒體標記（COX-IV，紅色）共定位的、游離在胞質中的綠色dsDNA信號陽性細胞比例。此外，為了更精確地定量胞質mtDNA水平，研究團隊進行了亞細胞組分分離，分離出不含線粒體和細胞核的純化胞質組分。利用針對線粒體特異性基因細胞色素c氧化酶1（mt-COX1）設計的引物，通過實時定量PCR（qPCR）技術，定量比較了cKO與對照組小鼠大腦胞質組分中mtDNA的拷貝數，並以核18S rDNA進行標準化。
cGAS-STING信號通路蛋白分析：在確認胞質mtDNA增加後，研究者系統地檢測了cGAS-STING通路下游信號分子的變化。他們提取了小鼠大腦皮層的總蛋白，通過蛋白質印跡法檢測了包括cGAS、STING、TBK1及其磷酸化形式（p-TBK1）、IRF3及其磷酸化形式（p-IRF3）在内的多個關鍵蛋白的表達水平。每個樣品上樣100µg總蛋白，使用β-actin或GAPDH作為內參進行標準化，並用Un-Scan-It軟件對條帶灰度值進行量化。
神經炎症及膠質細胞活化標誌物檢測：為驗證cGAS-STING通路激活是否導致了功能性神經炎症，研究進一步檢測了一系列促炎因子和膠質細胞活化標誌物。同樣通過蛋白質印跡法，分析了促炎轉錄因子NF-κB（包括其亞基p100和p52）、STAT1，以及下游炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNFα的水平。同時，為了評估神經炎症中至關重要的膠質細胞反應，檢測了星形膠質細胞活化的標誌物GFAP（膠質纖維酸性蛋白）和小膠質細胞/巨噬細胞的標誌物Iba1（鈣離子結合接頭分子1）的蛋白表達量。
大腦形態學觀察與壞死性凋亡檢測：為了評估蛋白酶體功能障礙是否導致了結構性腦損傷，研究直接比較了cKO與對照組小鼠的大腦外觀並稱量了全腦濕重。在細胞死亡方式的研究上，首先檢測了經典凋亡的標誌物——cleaved caspase-3，但未發現顯著變化。因此，研究重點轉向壞死性凋亡。壞死性凋亡的關鍵執行蛋白（如磷酸化的MLKL）在被激活後會形成不溶性的澱粉樣樣聚集體。研究團隊參照先前文獻中的方法，使用遞增強度的緩衝液對腦組織進行連續分級提取：首先用TBS（Tris緩衝鹽溶液）提取可溶部分，沉澱再用含1% Triton X-100的TBST提取，最後將TBST不溶的組分用含8M尿素和5% SDS的強變性緩衝液溶解，得到尿素不溶組分。他們通過蛋白質印跡法，重點檢測了這些尿素不溶組分（即激活後形成的不可溶複合物）中壞死性凋亡的關鍵蛋白：RIPK1、RIPK3、MLKL以及其磷酸化形式（p-MLKL, Ser345位點）的水平。
統計分析：所有定量數據均以均值±標準差表示。使用GraphPad軟件進行作圖和統計分析。對於cKO組與對照組的比較，採用非配對、雙尾的Mann-Whitney U檢驗。P值小於0.05被認為具有統計學顯著性。
主要研究結果 本研究獲得了一系列相互印證、邏輯連貫的結果，層層深入地揭示了蛋白酶體功能障礙引發神經炎症與壞死性凋亡的信號軸。
PSMC1敲除導致線粒體DNA釋放入胞質：免疫熒光結果清晰顯示，與對照組相比，3月齡cKO小鼠大腦皮層中，不與線粒體共定位的胞質綠色dsDNA信號顯著增加，表明胞質中存在大量游離的dsDNA沉積。定量分析表明這種增加具有高度顯著性。同時，線粒體標記COX-IV的信號也更強，這與既往研究中該模型線粒體碎片化的發現一致。更為精確的qPCR結果直接證實，cKO小鼠大腦胞質組分中的mtDNA（mt-COX1）拷貝數顯著高於對照組，而核DNA（18S）無此變化，明確了這些胞質dsDNA主要來源於線粒體。這一結果是後續所有發現的起點，將蛋白酶體功能障礙與胞質內源性DNA的積累聯繫起來。
胞質mtDNA積累激活cGAS-STING信號通路：蛋白質印跡分析顯示，cKO小鼠大腦皮層中，cGAS和STING的蛋白水平均顯著上調。更重要的是，其下游信號分子p-TBK1（激活形式）和TBK1的總量也顯著增加，表明該通路被強力激活。雖然IRF3總量有增加，但其磷酸化形式p-IRF3的變化未達顯著性，提示在該模型中，通路的激活可能更傾向於通過TBK1激活其他下游效應分子（如NF-κB），而非典型的I型干擾素反應。這些數據有力地證明，蛋白酶體功能障礙引起的胞質mtDNA釋放，足以觸發先天免疫感應的核心通路——cGAS-STING信號。
cGAS-STING通路激活引發顯著神經炎症及膠質細胞活化：正如理論預期，cGAS-STING通路的下游效應在cKO大腦中得到驗證。NF-κB通路被激活，其亞基p100和p52水平顯著升高。促炎轉錄因子STAT1以及重要的神經免疫調節因子TREM2也顯著增加。關鍵的促炎細胞因子，包括IL-1β、IL-6和TNFα，在cKO大腦中的表達量均顯著上調。這一系列變化共同描繪出一幅活躍的神經炎症圖景。此外，星形膠質細胞標誌物GFAP和小膠質細胞標誌物Iba1的蛋白水平也顯著升高，這直接證明了伴隨神經炎症的發生，大腦中的兩種主要膠質細胞均被激活，處於反應性狀態。
蛋白酶體功能障礙導致大腦萎縮並誘導壞死性凋亡：形態學觀察發現，3月齡cKO小鼠的大腦體積明顯小於對照組，腦濕重顯著減輕，提示存在神經元丟失和腦萎縮。在探究細胞死亡機制時，研究者發現經典凋亡標誌物cleaved caspase-3並未增加，排除了凋亡是主要死亡方式的可能性。然而，在代表蛋白不溶性聚集的尿素提取組分中，他們發現壞死性凋亡的關鍵蛋白發生了劇烈變化：磷酸化的MLKL（p-MLKL）、總MLKL、RIPK1以及RIPK3的水平在cKO大腦中均顯著高於對照組。這些蛋白在不可溶組分中的富集，正是其被激活、形成壞死體（necrosome）複合物並最終執行細胞膜打孔功能的典型特徵。這項結果至關重要，它將上游的蛋白酶體功能障礙、cGAS-STING通路激活及神經炎症，與最終導致神經元丟失的具體死亡方式——壞死性凋亡，直接聯繫了起來。
結論與價值 本研究得出核心結論：在前腦神經元中特異性破壞蛋白酶體功能（通過敲除PSMC1），會導致線粒體DNA釋放到細胞質中。這些釋放的mtDNA作為內源性危險信號，被cGAS感應，從而激活STING依賴的先天免疫信號通路。該通路的激活引發了強烈的神經炎症反應，包括促炎細胞因子釋放和膠質細胞活化。最終，這種炎症微環境和/或相關信號共同作用，激活了壞死性凋亡的執行機器（RIPK1/RIPK3/MLKL），導致了程序性壞死形式的神经元死亡，並在整體上表現為大腦萎縮。
其科學價值在於：首次在神經元特異性蛋白酶體功能障礙的動物模型中，系統地闡明了一條從蛋白酶體損傷到神經元壞死性凋亡的完整信號通路（蛋白酶體功能障礙 → 線粒體損傷/碎片化 → mtDNA釋放 → cGAS-STING通路激活 → 神經炎症 → RIPK1/RIPK3/MLKL介導的壞死性凋亡）。這一發現為理解阿爾茨海默病等以蛋白酶體功能下降、神經炎症和神經元丟失為特徵的神經退行性疾病的發病機制提供了全新的、具有因果邏輯的解釋框架。它提示，針對cGAS-STING通路或壞死性凋亡關鍵節點的治療策略，可能對緩解由蛋白酶體功能障礙驅動的神經退行過程具有潛在療效。
研究亮點 1. 模型特異性與因果關聯性強：使用神經元特異性的條件性敲除小鼠模型，避免了全身性敲除可能導致的發育缺陷或其他系統性影響，使研究結論能更直接地指向神經元內在的蛋白酶體功能障礙所引發的後果。 2. 機制闡釋的完整性與層次性：研究設計邏輯嚴謹，從現象（胞質DNA積累）到信號通路激活（cGAS-STING），再到功能後果（炎症因子表達、膠質活化）和終極細胞命運（壞死性凋亡），層層遞進，構建了一個近乎完整的病理機制鏈條。 3. 方法學上的精準運用：在檢測胞質mtDNA時，結合了特異性免疫熒光染色和亞細胞組分分離後的qPCR定量，互為補充，證據力強。在檢測壞死性凋亡時，採用了分級提取法重點分析不溶性組分，準確捕獲了激活狀態的壞死性凋亡信號，方法得當。 4. 連接了兩個重要的病理過程：成功地將“蛋白酶體功能障礙”和“壞死性凋亡”這兩個在神經退行性疾病中備受關注但此前關聯不直接的領域聯繫起來，並通過“mtDNA-cGAS-STING-炎症”軸提供了合理的連接機制，具有概念上的創新性。
其他有價值內容 研究者在討論部分也保持了審慎的態度，指出目前的研究結果主要揭示了這些事件之間的相關性（coincident），雖然信號通路邏輯清晰，但並未通過遺傳學或藥理學干預（例如敲低cGAS或使用STING抑制劑）來嚴格證明其因果關係。他們提出，蛋白酶體功能障礙可能創造了誘發壞死性凋亡的條件，而未來需要進一步的研究來確認mtDNA釋放與cGAS-STING激活之間、以及該通路激活與壞死性凋亡執行之間的確切因果關係。此外，研究得到美國國立衛生研究院/國家老齡化研究所（NIH/NIA）的經費支持（RF1 AG072510），體現了該研究主題在衰老及年齡相關疾病領域的重要性。