《Angiogenesis》期刊2025年发表的这项突破性研究由德国格赖夫斯瓦尔德大学医学中心人类遗传学系Dariush Skowronek领衔，联合10所科研机构的跨学科团队，通过高通量人血管类器官（blood vessel organoids）模型揭示了脑 cavernous malformations（CCM，脑海绵状血管畸形）三种致病蛋白（CCM1/2/3）的共性与特异性功能机制。该研究不仅开发了首个96孔板兼容的近乎无外源成分（xeno-free）的血管类器官分化方案，更通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和嵌合体类器官成像技术，阐明了CCM3突变导致更激进临床表型的细胞学基础。

作者与发表信息

通讯作者Dariush Skowronek来自德国格赖夫斯瓦尔德大学医学中心人类遗传学系及遗传与功能基因组学研究所，团队联合了罗斯托克大学皮肤科、莱布尼茨等离子体研究所、耶拿大学医院等多家机构。论文发表于《Angiogenesis》2025年第28卷，DOI: 10.1007/s10456-025-09985-5。

学术背景

CCM是中枢神经系统薄壁血管簇形成的病变，具有家族性（10-20%）和散发性两种形式。家族性CCM由CCM1（KRIT1）、CCM2或CCM3（PDCD10）基因功能缺失突变引起。尽管既往研究揭示了CCM的细胞水平隐性遗传特征（需双等位基因失活）及MEKK3-KLF2/4信号通路异常等机制，但CCM3突变为何导致更严重的临床表型仍不清楚。传统动物模型难以实现三种基因突变的系统比较，而血管类器官技术为在人类细胞背景下研究该问题提供了新契机。

研究流程与方法

1. 高通量血管类器官平台开发

团队改良了Wimmer的类器官分化方案，关键创新包括： - 96孔板标准化流程：使用PrimeSurface狭缝板（slit-well plate）实现培养基快速更换，Akura微孔板减少基质包裹，避免手工提取血管网络 - 无外源成分培养体系：用人源胶原I替代鼠源胶原，用化学定义的血小板裂解物（Panexin CD）替代胎牛血清（FBS） - 灌注验证系统：通过OrganoPlate Graft芯片和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型证实类器官血管形成功能（图1,2）

2. CCM基因敲除模型构建

• hiPSC工程化：采用Allen细胞库的荧光标记hiPSC系（AICS-0036-006 megFP和AICS-0054-091 mTagRFPt），通过CRISPR-Cas9构建CCM1/2/3单基因敲除（KO）系
• 质量控制：核型分析、多能性标志物（OCT4/SSEA4/SOX2/TRA-1-60）免疫荧光验证

3. 表型分析

• 类器官发育异常：CCM1/3 KO组在血管前体阶段即出现显著更大的聚集体积（p<0.001）和细胞间腔隙（ZO-1染色证实紧密连接缺陷）（图3）
• 血管网络缺陷：共聚焦显微镜显示所有KO组的血管内皮细胞（CD31+）与周细胞（PDGFR-β+）共定位降低，VE-cadherin连接呈现点状而非连续分布（图4）
• 单细胞转录组学：对10个类器官/基因型的scRNA-seq分析鉴定出11个细胞簇，发现：
  • 共有机制：成纤维细胞簇（C10）中COL3A1/EBF1/DLK1上调，与胶原纤维组织通路激活相关（图7）
  • 基因特异性效应：CCM1 KO在神经元样簇（C8）富集轴突发生相关基因；CCM3 KO在内皮簇（C9）特异性上调细胞-基质黏附基因（如CLDN5）（图5,6）

4. 嵌合体类器官实验

• 增殖差异：将KO与WT hiPSC按1:19比例构建嵌合体类器官，发现：
  • CCM1/3 KO细胞呈现”肿瘤样”扩张（megFP信号强度增加2.1倍和3.4倍，p<0.001）
  • CCM2 KO细胞反而增殖受限（图8a,b）
• 微环境依赖：二维共培养实验显示CCM3 KO内皮细胞的增殖优势在EndoGRO-MV培养基中更显著（p<0.01），提示生长因子敏感性改变（图8c-f）

主要发现与结论

1. CCM3特异性机制：CCM3缺失导致最严重的血管网络紊乱和内皮细胞克隆性扩增，与临床观察的侵袭性表型一致。scRNA-seq揭示其特异性影响ECM重塑（如HYAL2上调）和细胞黏附通路。
2. CCM2温和表型基础：CCM2 KO细胞增殖受限可能与CCM2L（旁系同源物）部分补偿MEKK3信号抑制有关，这为家族性CCM中CCM2突变患者病程较缓和提供解释。
3. CCM1神经关联：CCM1 KO在神经元样细胞簇的特异性转录改变（如GRM8下调）可能与其高癫痫发生率相关。

科学价值与亮点

1. 方法学突破：首创96孔板血管类器官分化方案，使通量提升5倍且减少80%操作时间，为药物筛选奠定基础。
2. 疾病机制阐释：首次在人类细胞模型系统比较三种CCM基因功能差异，揭示ECM重构和克隆选择是CCM3表型的关键驱动。
3. 转化医学意义：证实类器官可用于模拟CCM的”二次打击”假说，并为靶向MEKK3-KLF2/4或PI3K-mTOR通路的个性化治疗提供测试平台。

补充价值

研究还发现CCM类器官中周细胞源性DLK1（一种肿瘤周细胞标志物）的普遍上调，提示CCM可能具有类似肿瘤的微环境特征，这为探索抗血管生成药物（如舒尼替尼）的repurposing提供了新思路。