该研究于2025年4月30日发表于美国化学学会（American Chemical Society）旗下的期刊 *ACS Synthetic Biology*，题为《将无细胞蛋白质合成作为快速筛选机器学习生成蛋白酶变体的方法》。主要作者包括来自英国爱丁堡大学工程生物学中心、定量生物学、生物化学与生物技术研究所生物科学学院的Ella Lucille Thornton（第一作者兼通讯作者）、Jeremy T. Boyle、Nadanai Laohakunakorn以及Lynne Regan（通讯作者）。
这项研究属于合成生物学、蛋白质工程与机器学习交叉的前沿领域。随着AlphaFold等机器学习（ML）工具在蛋白质结构预测和设计领域取得革命性进展，高质量的训练数据成为了限制其进一步应用的关键瓶颈。传统上，为机器学习模型收集蛋白质变体的功能数据（如催化速率）依赖于体内表达、纯化与表征，这一过程耗时耗力，难以满足ML项目通常需要成百上千个变体数据来进行有效训练的需求。因此，开发一种快速、高通量的蛋白质功能筛选方法，以高效生成高质量的“序列-功能”数据并指导机器学习模型，对于推动蛋白质设计至关重要。本研究的目标正是展示无细胞蛋白质合成（Cell-Free Protein Synthesis， CFPS）作为一种简单、快速的工具，在机器学习工作流程中用于筛选和评估蛋白质变体活性的效用，并通过优化一种蛋白酶的动力学特性来验证这一工作流程的有效性。
研究的详细工作流程可以概括为“创造（Create）-测试（Test）-学习（Learn）”三个循环往复的阶段，并以一种名为Con1的设计蛋白酶作为模型系统进行验证。
首先，研究人员确定了待突变的目标残基。他们使用AlphaFold3对Con1蛋白酶与其底物肽的复合物进行了结构建模。随后，利用Robetta Alanine Scan（计算丙氨酸扫描）工具，预测了六个对底物结合有显著贡献的非催化残基：H167、L169、F172、L217、Q218和E219。根据它们在预测结构中的位置，这六个残基被分为两个区域进行独立突变：区域A（H167， L169， F172）和区域B（L217， Q218， E219）。
第一阶段：稀疏采样与初始数据收集（创造与测试） 1. 变体创造：针对每个区域（A和B），研究人员通过Python脚本随机生成了48个变体。在每个变体中，该区域的三个残基被同时随机突变为任何其他氨基酸，而不是传统的逐个突变。这样，每个区域都产生了48个独特的突变组合。 2. 蛋白质合成：为这总共96个变体（每个区域48个）合成了线性DNA模板。将这些DNA模板与自制的CFPS试剂（含有大肠杆菌裂解液、氨基酸、能量组分等）混合，在37°C下孵育3.5小时，直接在体外合成了蛋白酶变体。整个CFPS反应在384孔板中进行，体积仅为5微升。 3. 活性测试：蛋白质合成后，直接在同一个孔板中进行活性测定。向每个CFPS反应体系中加入基于荧光共振能量转移（FRET）的底物。该底物是一个纯化的融合蛋白，其中供体蛋白（CFP）和受体蛋白（YFP）通过Con1的特异性切割位点连接。当蛋白酶切割底物时，FRET信号会随时间减弱。通过酶标仪监测供体和受体的荧光强度，计算FRET比率随时间的变化，从而获得每个变体的底物切割初始速率。整个“生产加筛选”流程仅需6小时即可完成。 4. 数据评分：将每个变体切割底物的初始速率数据归一化至野生型Con1的活性，得到一个“适应度”（Fitness）分数。在本研究中，适应度被定义为在单一固定底物浓度下，底物切割初始速率的提升。
第二阶段：机器学习引导的定向进化（学习与再创造、再测试） 1. 机器学习模型训练：将第一阶段获得的96个随机变体的序列（用独热编码表示）及其对应的适应度分数作为训练数据，输入到一个名为“主动学习辅助的定向进化”（Active Learning-Assisted Directed Evolution， ALDE）的机器学习工作流程中。ALDE利用深度神经网络（DNN）集合来学习序列与适应度之间的映射关系。 2. 变体建议与新一轮筛选：训练后的ALDE模型通过平衡“利用”（预测具有高适应度的变体）和“探索”（模型对其预测不确定性高的变体），提出了下一批最有希望优化适应度的变体建议。 3. 合成与测试建议变体：研究人员根据模型的建议，合成了新的变体进行验证。鉴于区域A的随机变体大多无活性，他们只合成了10个ML建议的变体进行筛选。而对于结果更积极的区域B，他们合成了排名前32的ML建议变体。这些新变体同样通过CFPS合成和FRET活性测定进行评估，获得了新一轮的适应度数据。
数据与分析：FRET时间过程数据被截取在FRET比率=0.55以内的线性区间，以准确反映初始反应速率。使用GraphPad Prism对线性部分进行拟合，得到斜率值作为“速度”指标。每个变体的三个重复实验的平均斜率被归一化至野生型Con1的平均值，得到最终的适应度分数。机器学习部分的计算在爱丁堡计算与数据设施（ECDF）的资源上完成。
研究的主要结果清晰地展示了这一工作流程的有效性：
1. 稀疏采样揭示了功能关键残基与区域耐受性差异： 对初始96个随机变体的筛选显示了区域A和区域B对突变的惊人差异耐受性。区域A的突变耐受性极差，48个变体中绝大多数完全失活（图4a）。仅有的几个有活性的变体（如最好的A10，序列QLF）其序列也与野生型（HLF）非常相似，且没有变体活性超过野生型。这表明区域A的残基对蛋白酶功能可能至关重要。相比之下，区域B的变体则表现出广泛的活性范围（图4b），所有48个变体都表现出一定的活性，并且多个变体的活性超过了野生型Con1。这一结果不仅为后续的机器学习训练提供了两类对比鲜明的数据集（一个“严苛”，一个“宽松”），也提供了通过实验筛选才能获得的、超越单纯序列保守性分析的关键功能信息。
2. 机器学习引导成功提升了蛋白酶的适应度： 将初始随机采样的数据输入ALDE模型后，模型提出的建议变体在第二轮筛选中显著提升了性能。 对于区域A，尽管找到高活性变体的可能性较低，但筛选的10个ML建议变体中，90%具有活性，远高于初始随机变体的约20%（图5b）。虽然最佳变体的适应度仅与野生型相当（如变体HLL），但平均适应度和最大适应度均较随机批次有所提升。这证明了ALDE即使在功能关键、突变不耐受的区域，也能成功识别出保持功能的重要残基模式。 对于区域B，结果更为显著（图5c）。筛选的32个ML建议变体中，许多活性超过了野生型Con1。平均适应度和最大适应度相比随机批次均有明显提高。其中，表现最佳的变体TB27（在217、218、219位点的氨基酸为FSN）的适应度达到了野生型Con1的4倍。这直接实现了研究的目标——通过结合CFPS和ML，快速发现性能显著提升的酶变体。
3. CFPS筛选结果与纯化蛋白活性一致： 为了验证在CFPS混合物中观察到的活性差异确实源于蛋白酶本身催化活性的不同，而非表达量差异，研究人员选择了四个在CFPS筛选中表现出不同活性水平的变体（包括最佳变体TB27、随机批次中的优秀变体B8、活性较差的变体B31以及无活性的区域A变体A13）。将这些变体在大肠杆菌中表达、纯化、定量至相同浓度（0.1 μM）后进行FRET活性测定（图6）。结果显示，纯化蛋白的活性趋势与直接在CFPS中测定的趋势完全一致。这一关键对照实验证实，CFPS快速筛选所反映的活性差异是真实的酶催化活性差异，证明了该筛选方法的可靠性。
本研究的结论是，无细胞蛋白质合成（CFPS）是一种直接、快速、易获取的酶变体筛选工具。将其与机器学习工具策略性地结合，可以有效导航蛋白质“适应度景观”，快速优化目标活性。这项研究通过快速发现一个催化速度提升4倍的蛋白酶变体，有力演示了这一强大工作流程。
该研究具有重要的科学价值和应用价值。科学价值在于：它成功地将高通量实验（CFPS）与智能计算设计（ML）闭环连接，为解决蛋白质工程中“数据饥渴”与“实验瓶颈”的矛盾提供了一个高效范式。它展示了即使在小型实验室、中等通量（几十到几百个样本）规模下，也能通过这种“创造-测试-学习”的快速迭代，有效探索复杂的蛋白质序列空间。应用价值在于：该工作流程通用性强，可适配于多种蛋白质设计目标（如结合亲和力、溶解度、产量等），仅需替换相应的功能测定方法。CFPS的开放系统特性允许添加细胞难以耐受的底物或控制特定反应条件，进一步拓宽了其应用场景。此外，该方法成本相对较低，易于在大多数实验室内部建立，降低了蛋白质工程优化的门槛。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：一、方法学创新：创造性地将CFPS的快速生产能力与机器学习的数据驱动决策能力深度融合，形成了一套高效、可迭代的蛋白质设计-筛选-优化流水线。二、显著提升的效率：仅用总共138个变体的筛选（初筛96+ML引导筛选42），在极短的时间内（每个批次仅需6小时）便将目标蛋白酶的催化性能提升了4倍，展示了远超传统方法的速度优势。三、验证充分：通过将CFPS筛选结果与传统的纯化蛋白定量测定结果进行对比，严谨地证明了CFPS筛选数据的可靠性，增强了整个工作流程的说服力。四、揭示未知生物学信息：实验性稀疏采样发现了计算分析未能预测的区域耐受性差异，凸显了实验筛选在补充和验证计算预测方面不可替代的价值，说明了在脱离生物体原有环境后，酶的最优功能序列可能与进化保守序列不同。
其他有价值的内容包括：作者在讨论部分提出了对该工作流程的潜在改进建议，例如在设计的蛋白质C端添加定量标签，以标准化不同变体的表达水平，从而更精确地评分比活性。此外，他们还指出可以通过使用更快速的商业化CFPS系统或引入自动化移液机器人来进一步提升实验通量和速度。这些思考为后续研究者优化和拓展该方法提供了明确的方向。