本研究由来自加州大学圣地亚哥分校Skaggs药学院（Wenjing Liang, Shakti Sagar, Rishith Ravindran等）、医学系（Justin M. Quiles, Eric D. Adler等）以及外科学系（David M. Cauvi, Antonio De Maio等）的研究人员共同完成，通讯作者为Åsa B. Gustafsson。该研究于2023年发表于《自然-通讯》（*Nature Communications*）期刊，题为“当溶酶体功能受损时，线粒体通过细胞外囊泡被分泌”（Mitochondria are secreted in extracellular vesicles when lysosomal function is impaired）。

学术背景 本研究的科学领域聚焦于细胞器质量控制与细胞间通讯，特别是心肌细胞的线粒体质量控制和细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）生物学。线粒体是心脏收缩所需ATP的主要来源，功能失调的线粒体会产生活性氧并激活细胞死亡通路，因此必须被有效清除。在心肌细胞等终末分化细胞中，主要通过自噬-溶酶体途径来降解受损线粒体。然而，当溶酶体功能因衰老、疾病或药物而受损时，细胞如何处理这些待降解的“垃圾”尚不清楚。有证据表明，在神经退行性疾病中，错误折叠的蛋白质可通过EVs被清除。此外，一些研究也发现EVs中存在线粒体蛋白，但其释放机制和功能未知。本研究旨在探究当溶酶体功能受损时，细胞是否以及如何通过分泌EVs来处置线粒体，并解析这一过程的调控机制及其在心脏病理生理学中的意义。

详细工作流程 本研究采用了从体外细胞模型到体内动物模型，再到人类疾病样本的多层次、系统性研究策略，工作流程包含以下几个主要部分： 1. 建立溶酶体功能受损模型与EVs分泌关联： 首先，研究团队使用小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs）作为研究对象。他们用溶酶体酸化抑制剂巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1, Baf A1）处理细胞，模拟溶酶体功能受损。通过差速离心法从细胞培养上清中分离大EVs（10,000 × g沉淀）和小EVs（100,000 × g沉淀，即传统的外泌体）。使用蛋白质印迹法分析EVs标志物（Alix, TSG101, CD81）和线粒体蛋白（TIM23, TOM20, MTCO1）。同时，他们向小鼠体内注射氯喹（Chloroquine）以在体干扰溶酶体功能，并从心脏组织中分离EVs进行分析。此外，研究还构建了心肌细胞特异性表达线粒体荧光蛋白（Mito-Dendra2）的转基因小鼠，以追踪心脏来源EVs中线粒体的起源。 2. 探究Rab7 GTPase的关键作用： 由于Rab7是调控晚期内体/多囊泡体（Multivesicular Bodies, MVB）与溶酶体融合的关键小GTP酶，研究团队假设其缺失可能改变MVB的运输方向。他们使用野生型（WT）和Rab7基因敲除（Rab7−/−）的MEFs，在基础状态下分析其EVs的分泌情况。除了蛋白质印迹，还采用了多种技术进行深入表征：a) 透射电子显微镜（TEM） 直接观察分离到的大EVs中是否存在完整的线粒体结构；b) 蛋白酶K保护实验 验证线粒体蛋白是否被囊泡膜保护，以确认其位于囊泡内部；c) 纳米颗粒跟踪分析（NTA） 测定EVs的粒径分布；d) 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析 全面比较WT与Rab7−/−细胞分泌的大EVs中的蛋白质组成，并进行基因本体（GO）富集分析；e) 免疫荧光和活细胞成像 观察细胞内CD81阳性囊泡与线粒体的共定位及动态相互作用。 3. 验证EVs分泌途径的独立性： 为了明确这一分泌途径是否依赖于经典的自噬或线粒体自噬（Mitophagy），研究团队使用了自噬关键基因（Atg5, Atg7）敲除的MEFs，以及PINK1（线粒体自噬的关键蛋白）敲低的MEFs。在给予Baf A1处理后，分析这些细胞EVs的分泌情况，特别是线粒体内容物的释放。此外，通过免疫荧光检测GFP-LC3（自噬体标志）与CD81的共定位，研究自噬体与内体系统是否融合形成两性体（Amphisome）。 4. 阐明分泌机制与功能后果： 研究团队发现Rab7−/−细胞中Rab27a（调控MVB与质膜对接的GTP酶）的表达显著上调。他们通过短发夹RNA（shRNA）敲低Rab7−/−细胞中的Rab27a，观察其对EVs分泌的影响。同时，检测了敲低Rab27a后细胞内泛素化蛋白水平的变化。为了评估抑制EVs分泌对细胞存活的影响，他们在敲低Rab27a的Rab7−/−细胞中施加溶酶体抑制剂（Baf A1）或线粒体呼吸抑制剂（寡霉素+抗霉素A），并使用Yo-Pro1染色评估细胞死亡。 5. 构建心脏特异性Rab7敲除小鼠模型进行在体验证： 将Rab7条件性敲除小鼠（Rab7f/f）与心肌细胞特异性、他莫昔芬诱导的Cre重组酶小鼠（Myh6-MerCreMer）杂交，获得成年小鼠心脏特异性Rab7敲除模型。通过超声心动图评估心脏功能，组织学染色（H&E, Masson三色）观察结构，透射电镜观察超微结构。从这些小鼠的心脏组织中分离EVs，分析其含量。同时，将该模型与Mito-Dendra2小鼠杂交，以确认心脏EVs中的线粒体来源于心肌细胞。此外，还通过免疫荧光、流式细胞术和3D成像分析，探究分泌的EVs在心脏组织中的去向，特别是与巨噬细胞的相互作用。 6. 在衰老和疾病模型中验证： 研究比较了年轻（4月龄）和老年（24月龄）野生型小鼠心脏组织中的EVs水平。同时，使用了溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）敲除小鼠（Danon病模型）的心脏组织。更重要的是，研究分析了来自两名Danon病患者的移植心脏活检样本，使用免疫亲和捕获法分离EVs，并与正常对照心脏进行比较。

主要结果 1. 溶酶体功能受损促进含线粒体的大EVs分泌： 在MEFs中，Baf A1处理显著增加了大小EVs标志物的分泌，且仅在大EVs中检测到线粒体蛋白（TIM23， TOM20， MTCO1）的富集，其水平随处理而升高。蛋白质组学分析证实，大EVs中独特富集膜结合细胞器（包括线粒体）相关蛋白。在体实验中，氯喹处理小鼠的心脏组织（而非血浆）中大EVs及其线粒体蛋白含量增加。从Mito-Dendra2小鼠心脏分离的EVs中检测到Mito-Dendra2信号，证实了线粒体源自心肌细胞。 2. Rab7缺失导致基础状态下EVs分泌增加： 与WT细胞相比，Rab7−/− MEFs在基础状态下即分泌更多的大、小EVs，且大EVs中含有丰富的线粒体蛋白（TIM23， MnSOD）和内质网蛋白（Calreticulin）。透射电镜直接观察到大EVs中存在完整的线粒体结构。蛋白酶K实验证实线粒体蛋白TOM20和囊泡标志物TSG101受到膜保护，而暴露在膜外的CD81被降解。蛋白质组学分析显示，Rab7−/−细胞来源的大EVs显著富集线粒体和内质网蛋白。免疫荧光和活细胞成像显示，Rab7−/−细胞中CD81阳性囊泡与线粒体的共定位显著增加。 3. EVs分泌途径独立于自噬和PINK1： 在Atg5−/− 或 Atg7敲低的MEFs中，Baf A1处理依然能诱导含线粒体的大EVs分泌增加，表明该过程不依赖于自噬体形成。同样，PINK1敲低也不影响EVs的分泌。然而，Rab7−/−细胞中自噬体标志LC3-II积累，但自噬适配蛋白p62并未堆积。免疫荧光显示，在Rab7−/−细胞及Baf A1处理的WT细胞中，GFP-LC3与CD81的共定位增加，提示自噬体可能与MVB融合形成两性体，从而通过EVs途径被分泌出去。 4. Rab27a介导分泌过程并具有细胞保护功能： Rab7−/−细胞中Rab27a的蛋白和mRNA水平极度上调（约45倍）。敲低Rab7−/−细胞中的Rab27a可几乎完全阻断EVs的分泌，并导致细胞内泛素化蛋白水平小幅但显著升高。更重要的是，当Rab27a被敲低、EVs分泌被抑制后，Rab7−/−细胞在遭受溶酶体或线粒体应激时，细胞死亡率显著升高。这表明，当内部降解途径受阻时，通过Rab27a介导的EVs分泌来处置泛素化货物等有害物质，对维持细胞存活至关重要。 5. 心脏特异性Rab7敲除激活EVs分泌并维持心脏稳态： 成年小鼠心肌细胞特异性敲除Rab7后，心脏结构和基线收缩功能基本正常，但出现了轻度心脏肥厚。电镜观察到心肌细胞内存在大量小空泡。尽管自噬流受损（LC3-II和p62积累），但线粒体呼吸功能正常。关键发现是，Rab7缺陷心脏的组织间隙中大EVs（含有线粒体蛋白TIM23和线粒体DNA）水平显著升高。从Rab7f/f MCM； Mito-Dendra2小鼠心脏分离的EVs中检测到Mito-Dendra2，确证了线粒体来源。这些EVs并未大量进入循环，而是被心脏组织中的巨噬细胞吞噬（共聚焦3D成像显示巨噬细胞内存在Mito-Dendra2阳性线粒体），且未引发明显的炎症反应。 6. 衰老和Danon病心脏中EVs分泌增加： 在老年小鼠心脏和LAMP2敲除（Danon病模型）小鼠心脏中，均检测到含线粒体的大EVs水平升高。对两名Danon病患者心脏活检样本的分析进一步证实，与正常对照相比，患者心脏组织中富含线粒体的EVs显著增多。

结论与意义 本研究揭示了一种全新的线粒体质量控制机制：当溶酶体介导的内部降解途径功能受损或超负荷时，细胞可以通过内体途径，将线粒体及泛素化货物封装进大EVs中并分泌到细胞外。该过程由Rab7缺失或功能抑制所触发，并依赖于Rab27a的上调和介导。分泌的EVs主要被邻近的巨噬细胞吞噬并最终在溶酶体中降解，从而避免了有害物质在细胞内的累积，起到了“替代性垃圾处理”的作用。这一通路独立于经典的自噬，但自噬体可通过与内体融合形成两性体而利用此途径被清除。

其科学价值在于：1) 拓展了细胞质量控制的范式，明确了在内部降解系统失灵时，细胞存在一个主动的“外排”备份系统。2) 深化了对EVs生物学功能的理解，除了众所周知的细胞间通讯功能，EVs在某些病理生理状态下可作为细胞废物处置的载体。3) 阐明了Rab7和Rab27a在细胞器运输抉择中的关键作用，Rab7偏向于引导MVB与溶酶体融合进行降解，而其缺失则“切换”至Rab27a介导的与质膜融合进行分泌。4) 为理解心脏衰老和Danon病等疾病的代偿机制提供了新视角，这种EVs介导的清除途径可能在疾病早期起到保护作用，延缓病理进程。

研究亮点 1. 重要的原创性发现： 首次系统性地论证了“溶酶体功能受损→Rab7信号改变→Rab27a上调→含线粒体/泛素化货物的大EVs分泌→巨噬细胞清除”这一完整的替代性质控通路。 2. 研究方法的系统性与创新性： 结合了遗传学（多种基因敲除/敲低细胞系和条件性基因敲除小鼠）、药理学、先进的显微成像技术（CLEM， 活细胞成像， 3D重构）、蛋白质组学和多模型验证（细胞、小鼠、人类样本），提供了多层次的确凿证据。 3. 生理与病理意义的直接关联： 不仅在细胞模型中阐明了机制，更在心脏特异性敲除模型、衰老模型和人类遗传病样本中验证了该通路的在体激活，使研究发现具有明确的生理和病理生理相关性。 4. 提出了具有普适性的细胞学概念： 该研究揭示的“内部分解代谢受阻时激活外排分泌”的细胞策略，可能不仅适用于线粒体，也适用于其他待降解的细胞组分，为理解多种蛋白质聚集性疾病和衰老相关疾病提供了新思路。

其他有价值的发现 研究还提示，不同表面标志的EVs亚群可能具有货物特异性（如本研究中的CD81阳性囊泡特异性地携带线粒体），而CD63阳性囊泡则不然。此外，线粒体去极化（FCCP处理）虽能诱导线粒体自噬，但同时也增强了含线粒体的大EVs分泌，而减少了小EVs的分泌，表明不同应激对不同EVs亚群的分泌具有差异性调节。这些细节为进一步研究EVs的异质性和功能分工提供了线索。