本研究由Nico van den Beld、Melina Fischer、Melanie Scharr、Simon Scherer、Rudi Beschorner、Bernhard Hirt以及Peter H. Neckel共同完成，作者主要来自德国图宾根大学临床解剖与细胞分析研究所、图宾根大学儿童医院儿科外科以及图宾根大学医院病理与神经病理学研究所神经病理科。该研究成果以原创研究文章的形式，发表于学术期刊 neurogastroenterology & motility 2026年刊，文章标题为“Perlecan, collagen XVIII, and agrin expression in normo-, hypo-, and aganglionic segments in Hirschsprung’s disease”。

本研究所属的科学领域主要是胃肠神经生物学和发育病理学，聚焦于细胞外基质在肠神经系统发育和疾病中的作用。研究团队之所以开展此项工作，是因为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖作为细胞外基质的重要成分，能够与多种形态发生素、生长因子和信号分子相互作用，已知在动物模型中影响着肠神经系统的发育，并可能参与先天性巨结肠等肠神经病变的发病机制。然而，关于这些HSPG在人类先天性巨结肠患者中的具体表达模式，此前缺乏详细的描述。因此，本研究的核心目标是：在人类肠道组织中，系统性地表征分泌型HSPGs——包括基底膜蛋白聚糖（Perlecan）、胶原蛋白XVIII（Col18a1）以及聚集蛋白（Agrin）——的表达模式，并比较它们在先天性巨结肠患者健康肠段、病变肠段以及非先天性巨结肠对照组织中的差异，从而将动物模型中获得的关键发现转化应用于人类疾病研究。

本研究的工作流程严谨而详尽，主要包含六个关键步骤。 第一步骤是样本的获取与分组。 研究共纳入三类组织样本：第一类是来自8名（2女/6男，年龄3-23个月）先天性巨结肠患者的肠切除标本，共计10个样本，其中包含神经节细胞正常的肠段（normoganglionic）、神经节细胞减少的过渡区（hypoganglionic）以及无神经节细胞区（aganglionic）。第二类是非先天性巨结肠对照样本，来自9名（4女/5男，年龄3个月至14岁）因其他胃肠道疾病（如肠造口还纳、肠重复畸形等）接受手术的儿科患者。第三类是用于验证年龄影响的一例成人（92岁）遗体捐献者的小肠样本，该个体生前无胃肠道疾病史。所有样本的获取均通过当地伦理委员会批准并取得知情同意。这一多样本的设置确保了研究结果具有较好的代表性和对比性。 第二步骤是组织的病理学处理与切片制备。 对于先天性巨结肠患者的长段结肠切除标本，研究采用了改良的“瑞士卷”技术进行处理。具体而言，将结肠纵向剖开，制成条带状，然后从头端向尾端卷成紧密的卷状物，再进行冰冻包埋。这种方法的优势在于，可以在一个连续的组织切面上观察到从神经节细胞正常区到无神经节细胞区的完整过渡，便于精确定位和比较不同区域。对于非先天性巨结肠对照样本和成人遗体样本，则采用标准的冰冻切片技术处理。所有组织均被制成14-16微米厚的冰冻切片用于后续染色。 第三步骤是关键蛋白的免疫荧光染色实验。 这是本研究揭示蛋白表达空间分布的核心方法。研究团队对组织切片进行了多重免疫荧光染色，使用的目标抗体针对三种分泌型HSPG：Perlecan、Col18a1和Agrin。同时，为了精确定位肠神经节细胞，尤其是那些在病变区域可能已失去成熟神经元标记物但仍存在的未成熟或前体细胞，研究还采用了多种神经元标记物进行共染色，包括成熟神经元标记物PGP9.5和HuC/D，神经前体/未成熟神经元标记物P75（神经营养因子受体）和DCX（双皮质素），以及神经嵴细胞及神经元分化关键转录因子PHOX2B。实验流程包括：组织切片封闭、一抗孵育过夜、荧光二抗孵育、DAPI复染细胞核，最后封片。所有成像参数在整个研究过程中保持一致，以确保不同样本间荧光信号强度的可比性。此外，研究还提供了所有二抗的阴性对照，保证了染色结果的特异性。 第四步骤是显微成像与图像分析。 研究人员使用配备有Apotome模块的蔡司Axio Imager Z1荧光显微镜，在多个放大倍数下（5倍、10倍、20倍物镜）对染色切片进行系统性的图像采集。重点观察区域包括：黏膜隐窝基底膜、黏膜下层和肌肉层内的血管、环肌层与纵肌层之间的肌间神经丛区域、以及各层平滑肌细胞周围。图像处理使用蔡司ZEN软件进行拼接、合并伪彩色以及调整对比度，以便清晰展示蛋白的共定位情况。 第五步骤是单细胞测序数据的挖掘分析。 为了从转录组层面验证并补充免疫染色的发现，并探究HSPG的表达来源细胞类型，本研究重新分析了已公开发表的人类结肠单核RNA测序数据集（来自Drokhlyansky等人，2020年）。研究团队利用该数据库的在线分析工具，专门检索了Perlecan（HSPG2）、Col18a1（COL18A1）和Agrin（AGRN）基因在不同细胞簇（如神经元亚型、胶质细胞、平滑肌细胞、间质细胞、内皮细胞等）中的表达情况。这一生物信息学分析为免疫染色观察到的蛋白分布提供了分子水平的证据，并帮助推断产生这些基质蛋白的可能细胞来源。 第六步骤是数据分析与结果解读。 研究通过系统性地对比不同样本、不同肠段区域（正常、减少、无神经节）的免疫荧光图像，定性描述三种HSPG的表达模式、强度及分布变化。同时，结合单细胞测序数据的定量表达信息，综合分析HSPG在肠道，特别是肠神经节周围的表达特征及其在先天性巨结肠病变过程中的动态改变。整个工作流程从宏观组织处理到微观蛋白定位，再到分子水平的基因表达验证，构成了一个完整、立体的研究体系。

本研究取得了多项重要且相互关联的结果，系统地揭示了三种分泌型HSPG在人类肠道及肠神经系统中的表达模式及其在先天性巨结肠中的变化规律。 首先，在神经节细胞正常的肠段，三种HSPG均构成肠神经节周围的基底膜样结构。 在先天性巨结肠患者的正常肠段以及非先天性巨结肠对照儿童的结肠中，免疫染色显示Perlecan、Col18a1和Agrin均以精细、连续的环状结构，清晰地包裹在肠肌间神经丛和黏膜下神经丛的神经节周围，形成一层“神经节周鞘”。除了这一共性，它们在其他组织的分布上存在差异：Perlecan还在平滑肌细胞周围形成显著的“蜂窝状”网络，并在血管基底膜和肠隐窝上皮基底膜中强阳性表达。Col18a1在平滑肌中的表达很弱，但在血管基底膜和肠隐窝基底膜中表达强烈。Agrin的分布模式与Perlecan类似，在肌肉、血管和上皮基底膜均有表达，但在肌肉中的“蜂窝状”结构不如Perlecan清晰。值得注意的是，在92岁成人供体的肠组织中，三种HSPG的表达模式与儿童样本高度相似，表明它们是肠道基质中稳定存在的成分，其表达不随年龄增长而发生根本性改变。 其次，在神经节细胞减少的过渡区，HSPG的表达模式得以维持，而成熟神经元标记物可能已丢失。 这是本研究一个关键而有趣的发现。在“瑞士卷”切片上，研究人员观察到从正常区到病变区的过渡区域，神经节的数量和大小显著减少，神经节间距增大。在这些区域的神经节中，成熟的神经元标记物PGP9.5的免疫反应性会突然消失或显著减弱。然而，未成熟/前体神经元标记物如PHOX2B、P75和DCX在这些神经节中仍然清晰可见。至关重要的是，尽管神经节不成熟且神经元分化标记缺失，但包裹这些“低神经节”的Perlecan、Col18a1和Agrin免疫阳性鞘层依然存在，其形态和强度与正常神经节周鞘基本无异。这一结果表明，HSPG构成的神经节周基质环境的形成或维持，可能与神经元的完全成熟分化是相对独立的事件。 第三，在无神经节细胞区，HSPG在肌间层的表达显著减少或消失，但在非神经组织中表达不变。 在完全缺乏肠神经节细胞的区域，免疫染色显示，在环肌与纵肌之间的结缔组织层（即肌间神经丛原本应存在的位置），Perlecan、Col18a1和Agrin的信号均明显减弱或无法检测到。这一消失是与神经节细胞的缺失同步发生的。然而，在同一个无神经节肠段的相邻非神经组织中，包括平滑肌细胞周围、血管基底膜和肠上皮基底膜，三种HSPG的表达强度和模式与正常肠段相比几乎没有变化。这种“选择性消失”现象，通过对比整个“瑞士卷”连续切片上荧光强度的均一性得到证实，排除了染色技术造成的梯度假象。此外，在无神经节区常见的代偿性肥大的外来神经束周围，仍可检测到清晰的Perlecan表达。 第四，单细胞测序数据表明HSPG主要由肠道内的细胞，包括肠神经细胞自身表达。 对公共单细胞数据库的再分析显示，Perlecan（HSPG2）在多种结肠细胞类型中广泛表达，包括肠胶质细胞、肌细胞、内皮细胞，在神经元和起搏细胞中表达较低。Col18a1的表达则更集中于肠胶质细胞、神经元以及PDGFRA阳性的成纤维细胞样细胞。Agrin的表达则更多局限于神经元和胶质细胞亚群。进一步分析发现，不同的神经元亚型对三种HSPG的表达存在差异，例如Perlecan和Agrin在某些兴奋性运动神经元和感觉神经元亚群中表达较高，而Col18a1则在抑制性运动神经元中更常见。这些数据有力地支持了免疫染色的观察结果，并提示包围神经节的HSPG鞘层很可能部分由肠神经系统的神经元和胶质细胞自身分泌产生，塑造了其独特的微环境“壁龛”。 这些结果层层递进，首先确立了HSPG在人类正常肠神经系统中作为神经节周基底膜成分的基本事实；然后揭示了在病变早期（神经节细胞减少但尚存时），这一基质结构仍相对保守；最终明确指出，在病变终末阶段（神经节完全缺失），HSPG在神经节位置的特异性表达也随之消失。这构成了支持研究结论的坚实数据链。

本研究的结论是：分泌型硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Perlecan、Col18a1和Agrin是人类肠道，特别是肠神经系统中神经节周基底膜的关键组成成分。在先天性巨结肠中，它们在神经节正常区和减少区的表达模式与对照组相似，表明其表达独立于神经元的完全成熟分化状态。然而，在无神经节肠段，这三种HSPG在肌间层的表达与肠神经节细胞一同消失，而在其他肠壁组织中表达维持不变。这一发现成功地将动物模型中关于HSPG在肠神经系统发育中作用的重要成果转化至人类患者，为理解细胞外基质在先天性巨结肠病理机制中的作用提供了直接的人类组织证据。 本研究的科学价值与应用价值体现在多个方面。在科学认知层面： 它首次在人类组织中系统描绘了这三种重要HSPG在肠神经系统中的空间分布图谱，并将它们与先天性巨结肠的病理分期（正常、减少、无神经节）动态关联起来。研究提出，由神经细胞自身可能参与分泌的HSPG所构成的神经节周鞘，不仅是一个结构支撑，更可能是一个功能活跃的“壁龛”，通过结合和调控Wnt、FGF、GDNF、BMP等多种信号分子，来影响肠神经系统的发育、稳态、甚至再生潜能。这为肠神经生物学开辟了从细胞外基质角度理解神经细胞微环境调控的新视角。在临床诊断潜在价值方面： 研究发现，尤其是Col18a1，因其在神经节周围染色强而在肌肉本底染色弱，可能作为一种辅助的免疫组化标记物，帮助病理医生在术中冰冻切片或常规病理检查中更快速、准确地识别肠神经节，尤其是在疑难病例或神经节减少的过渡区。在转化医学与未来治疗启示方面： 研究确认了Agrin在人类肠神经节周的表达，这支持了此前动物研究中关于抑制Agrin可以促进神经嵴源干细胞迁移的发现，为基于干细胞移植治疗先天性巨结肠等肠神经病变提供了潜在的新靶点。此外，研究提示对细胞外基质成分的深入理解，可能有助于开发针对肠神经系统损伤或退行性疾病的修复策略。

本研究的亮点突出。首先，重要的发现具有明确的转化意义： 研究成功搭建了从动物模型到人类疾病的桥梁，直接验证并扩展了动物实验的结论，证实了HSPG作为神经节周基质成分在人类肠神经系统中的保守性及其在疾病中的特异性改变，这种转化研究对于疾病机制的理解至关重要。其次，研究方法的系统性与针对性： 采用“瑞士卷”技术处理长段病变肠管，完美解决了在连续层面上观察病理渐变过程的难题，这是研究先天性巨结肠过渡区特征的理想方法。同时，联合使用成熟和未成熟神经元标记物与HSPG共染色，巧妙地揭示了在神经元分化停滞区域基质环境的稳定性，这一实验设计非常精妙。最后，多层次证据的整合： 研究不仅依赖于经典的免疫组织化学这一形态学“金标准”，还创造性地整合了公开的单细胞转录组数据，从蛋白质定位和基因表达两个层面相互印证，既直观展示了空间分布，又深入揭示了可能的细胞来源和表达异质性，使得论证更加全面和有力。 此外，研究还提出了若干有价值的观点供未来探索。例如，观察到某些神经元的胞体与神经节周鞘中Perlecan高信号区直接接触，提示神经元可能主动调节其周围基质的成分。同时，研究讨论了HSPG可能通过形成疏水区结合Wnt蛋白等形态发生素，从而在神经节局部塑造信号梯度，调控神经细胞稳态的假说。这些观点为后续的功能性研究指明了方向。这项研究是一项设计严谨、执行出色、分析深入的基础与转化相结合的工作，显著增进了我们对肠神经系统微环境构成及其在疾病中改变的认识。