本文献报告了一项原创性研究。这篇由Giulia Torriani, Jennifer Mayor, Gert Zimmer, Stefan Kunz, Sylvia Rothenberger, Olivier Engler（分别来自瑞士洛桑大学医院微生物研究所、瑞士病毒学和免疫学研究所、伯尔尼大学、斯皮茨实验室）团队完成的研究，题为《Macropinocytosis contributes to hantavirus entry into human airway epithelial cells》，发表于Virology期刊，在线发表日期为2019年2月21日，收录于该刊2019年第531卷。
研究的学术背景： 本研究属于病毒学，特别是病毒进入机制的研究领域。汉坦病毒（Hantavirus）是一类由啮齿动物携带的负链RNA病毒，可导致人类严重疾病，如肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（HCPS），死亡率高，且目前缺乏许可的疫苗和有效的抗病毒疗法，因此被视为重要的新兴公共卫生威胁。病毒通过吸入受污染啮齿动物排泄物的气溶胶传播，人类呼吸道上皮细胞很可能是其早期感染靶标。尽管之前的研究已经发现了一些候选细胞受体（如原钙粘蛋白-1 PCDH1、αvβ3整合素等），并且表明病毒通过受体介导的内存作用进入细胞，在酸化的内吞体（endosome）中发生膜融合，但关于致病性汉坦病毒（如旧大陆的汉坦病毒 HTNV 和新大陆的安第斯病毒 ANDV）进入人类呼吸道上皮细胞的具体路径和关键细胞因子仍不完全清楚。特别是，不同汉坦病毒可能利用不同的内吞途径（如网格蛋白依赖型、不依赖网格蛋白型），且这些途径可能具有细胞类型特异性。鉴于呼吸道上皮是病毒入侵的门户，阐明其进入机制对于开发新型抗病毒策略至关重要。因此，本研究旨在比较HTNV和ANDV进入人类呼吸道上皮细胞的途径，识别关键的细胞因子，并探究大胞饮作用（Macropinocytosis）是否在其中扮演角色。
详细的研究流程： 本研究整合了无偏筛选和靶向功能验证，分为以下几个主要步骤：
1. 建立并表征假病毒平台： * 研究材料与方法： 为了规避活汉坦病毒所需的生物安全三级（BSL-3）实验室限制，研究构建了基于重组水疱性口炎病毒（VSV）的假病毒系统。具体方法是，使用删除了自身糖蛋白（G）基因并携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和萤火虫荧光素酶（Luc）报告基因的VSV*ΔG-Luc病毒骨架。将表达HTNV或ANDV糖蛋白的质粒转染HEK293F细胞，然后用VSV-G蛋白反式互补的VSV*ΔG-Luc(VSV-G)感染这些细胞。汉坦病毒糖蛋白被包装到假病毒颗粒中，产生的假病毒（命名为VSV*ΔG-Luc(HTNV-G)和VSV*ΔG-Luc(ANDV-G)）具有感染性但不能产生子代病毒，可在BSL-2条件下操作。为降低残留VSV-G带来的背景，在假病毒生产过程中加入了中和性抗VSV-G单克隆抗体I1。 * 实验内容： * 滴定与特异性验证： 在A549人肺泡上皮细胞上滴定假病毒滴度，并验证抗VSV-G抗体能有效中和残留背景。 * 进入动力学分析： 通过“氯化铵阻断”实验测定假病毒从内吞体逃逸（即完成膜融合）所需的时间。将病毒在4°C下吸附于A549细胞，然后快速转移至37°C启动内化。在不同时间点加入氯化铵以升高内吞体pH，阻断后续的pH依赖性膜融合。16小时后计数eGFP阳性细胞，计算逃逸半衰期（t1/2）。作为对照，同时测试了从早期内吞体逃逸的VSV-G假病毒和从晚期内吞体逃逸的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）糖蛋白假病毒。 * pH敏感性分析： 在感染过程中加入不同浓度的氯化铵，观察对假病毒进入的抑制程度，计算半数抑制浓度（IC50），以评估触发膜融合所需的pH阈值。
2. 激酶抑制剂文库的筛选： * 研究材料： 使用了一个包含已知激酶抑制剂的化合物库（Screen-Well激酶抑制剂库，并补充了10种FDA批准的激酶抑制剂），覆盖主要的细胞信号通路。 * 实验流程： * 细胞毒性预筛： 在实验条件下，使用CellTiter-Glo法检测化合物对A549细胞ATP水平的影响，排除引起细胞活力下降超过20%的化合物。 * 筛选实验： A549细胞用化合物预处理30分钟，然后在药物存在下感染HTNV或ANDV假病毒（以及VSV-G假病毒作为对照）1.5小时。洗去药物和未进入的病毒，在含有氯化铵的培养基中培养16小时以阻止后续进入。通过荧光素酶活性测定感染水平。将重复两次独立筛选中均能稳定抑制感染超过70%的化合物视为“命中”化合物。
3. 对大胞饮作用途径的靶向功能验证： * 研究思路： 基于激酶筛选结果提供的线索（如MLCK抑制剂、EGFR抑制剂等命中），采用一套已被验证的、针对大胞饮关键调节因子的“诊断性”抑制剂进行深入研究。 * 实验流程： 使用A549细胞，以及后续用于验证的WI-26VA4人肺上皮细胞系。 * 基本特征验证： 检测假病毒进入对钠氢交换体（NHE）抑制剂EIPA（5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利）和肌动蛋白（actin）抑制剂（细胞松弛素D破坏肌动蛋白丝，jasplakinolide稳定肌动蛋白丝）的依赖性。通过剂量反应曲线评估抑制效果，并使用CellTiter-Glo监测细胞毒性。同时设置“进入后”处理对照，以排除抑制剂对病毒复制后期步骤的影响。 * 病毒诱导的细胞形态和肌动蛋白动力学变化： 将A549细胞与高滴度假病毒共同孵育，通过鬼笔环肽染色观察细胞形态（如变圆）和丝状肌动蛋白（F-actin）分布的变化。使用基于分级分离和Western Blot的定量方法，检测病毒暴露后细胞中球状肌动蛋白（G-actin）与F-actin比例的变化，以量化肌动蛋白的解聚情况。 * 大胞饮调节因子的功能分析： 使用一系列特异性抑制剂，探究不同调节因子在假病毒进入中的作用。包括：CDC42抑制剂Pirl1、Rac1抑制剂NSC 23766、p21激活激酶1（PAK1）抑制剂IPA-3、神经Wiskott-Aldrich综合征蛋白（N-WASP）抑制剂Wiskostatin、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂Wortmannin、肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合物抑制剂CK869、表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂Gefitinib、肝细胞生长因子受体（HGFR/c-Met）抑制剂EMD 1214063，以及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）抑制剂ML-7。通过感染率测定评估这些抑制剂对HTNV和ANDV假病毒进入的抑制效果。
4. 数据分析工作流程： * 实验数据通常以三次重复的平均值±标准差表示。 * 使用GraphPad Prism 7软件进行图表绘制和统计分析。 * 统计显著性通过单因素方差分析（One-way ANOVA）等进行评估，p值<0.05被认为具有统计学差异。 * 图像（如Western Blot条带）通过光密度测定法进行定量。
主要研究结果： 1. 假病毒平台验证结果： 成功制备了具有特异感染性的HTNV和ANDV假病毒，滴度达到10^5–10^6 IU/ml。氯化铵阻断实验显示，HTNV假病毒的内吞体逃逸半衰期小于30分钟，而ANDV假病毒大于45分钟，表明HTNV进入更快。pH敏感性实验表明ANDV假病毒对氯化铵更敏感，HTNV假病毒则能在较高pH（较早的内吞体）下融合，这与文献报道的两种病毒糖蛋白膜融合所需pH值不同（ANDV约pH 5.9，HTNV约pH 6.3）相符。有趣的是，VSV-G假病毒逃逸更快但对氯化铵更敏感，提示HTNV可能采用了不同的内吞途径。
2. 激酶抑制剂筛选结果： 筛选获得了HTNV和ANDV假病毒部分重叠但存在显著差异的激酶依赖性图谱。广谱酪氨酸激酶抑制剂Tyrphostin-9和化合物GF109203X对两者均有抑制。Sunitinib对HTNV有特异性抑制。特别值得注意的是，EGFR抑制剂Gefitinib和MLCK抑制剂ML-7、ML-9特异性地抑制了ANDV假病毒的进入，而对HTNV影响较小。这为ANDV进入可能涉及大胞饮作用（已知该途径常受EGFR和MLCK调控）提供了初步线索。
3. 大胞饮作用特征验证结果： * 对NHE和肌动蛋白的依赖性： EIPA能以剂量依赖的方式显著抑制HTNV和ANDV假病毒进入A549和WI-26VA4细胞，但不影响腺病毒5型（作为对照）的进入，且无显著细胞毒性。肌动蛋白抑制剂细胞松弛素D和jasplakinolide同样能有效抑制两种假病毒的进入，且“进入后”处理实验证明这种抑制是针对病毒进入步骤本身。 * 病毒诱导的细胞变化： 暴露于高滴度假病毒后，A549细胞出现类似于已知通过大胞饮进入的疫苗病毒（VACV）所诱导的细胞变圆现象。定量分析显示，HTNV和ANDV假病毒都能导致细胞G-actin/F-actin比率升高，表明肌动蛋白发生解聚，这是大胞饮激活的一个标志，尽管效果弱于VACV。 * 调节因子的差异需求： 这是本研究的核心发现之一。HTNV和ANDV进入都依赖于PAK1和N-WASP，且都不依赖Arp2/3复合物和Rac1。然而，两者在其他关键调节因子上表现出明显差异： * CDC42： 在A549细胞中，CDC42抑制剂Pirl1特异性抑制ANDV进入，对HTNV无影响；但在WI-26VA4细胞中，这种特异性不明显，提示存在细胞类型差异。 * PI3K： PI3K抑制剂Wortmannin特异性抑制ANDV进入，不影响HTNV。 * 受体酪氨酸激酶（RTK）： EGFR抑制剂Gefitinib对两者均有抑制，但对ANDV抑制更强；HGFR抑制剂EMD 1214063仅特异性抑制ANDV进入。 * MLCK： MLCK抑制剂ML-7对ANDV进入表现出极高的敏感性，而HTNV只在较高药物浓度下才被抑制。
结论： 本研究首次提供了证据，证明大胞饮作用是致病性汉坦病毒HTNV和ANDV进入人类呼吸道上皮细胞的一条重要途径。两种病毒的进入都严格依赖于大胞饮的标志性特征：钠氢交换体（NHE）和肌动蛋白。然而，它们在调控大胞饮的上游细胞信号因子方面存在显著的病毒特异性差异：ANDV的进入更广泛地依赖于多种信号节点，包括CDC42、PI3K、EGFR、HGFR和MLCK；而HTNV的进入对这些因子的依赖相对较少或较弱。这表明不同的汉坦病毒可能“劫持”了部分重叠但又不尽相同的细胞信号网络和调控机制来完成进入过程。
研究的价值与意义： * 科学价值： 拓展了对汉坦病毒细胞进入机制的理解，首次将大胞饮作用确立为汉坦病毒在呼吸道上皮细胞中的一种关键进入途径。揭示了不同汉坦病毒（旧大陆 vs. 新大陆）在利用细胞机制方面的异同，为研究病毒进化与宿主适应性提供了新视角。研究建立的假病毒筛选和验证工作流程，为安全研究高致病性病毒的进入机制提供了范本。 * 应用价值： 鉴定出的关键宿主因子（如EGFR、PAK1、N-WASP、MLCK等）可作为开发新型抗病毒药物的潜在靶点。由于这些因子是宿主蛋白，针对它们可能有助于开发广谱抗病毒策略，并降低病毒产生耐药性的风险。研究结果为理解汉坦病毒的早期感染和呼吸道嗜性奠定了分子基础。
研究的亮点： 1. 重要发现： 首次系统证明并比较了大胞饮作用在HTNV和ANDV进入人类呼吸道上皮细胞中的作用，并详细描绘了两种病毒在该途径中依赖的差异化信号网络。 2. 方法新颖性： 巧妙结合了无偏的激酶抑制剂库筛选和针对性的“诊断性”抑制剂验证，从发现线索到机制阐释，逻辑严谨。建立的基于VSV假病毒的、使用中和抗体降低背景的BSL-2安全研究平台，具有很高的实用价值。 3. 研究对象的特殊性： 聚焦于汉坦病毒感染的关键门户——呼吸道上皮细胞，填补了该领域的研究空白。同时关注了具有不同病理学和地理分布的代表性病毒株（HTNV和ANDV）的对比，增加了研究的广度和深度。
其他有价值的内容： 研究还讨论了其发现与近期其他研究的关联。例如，提到新发现的ANDV关键受体PCDH1也在呼吸道上皮细胞中表达，并参与上皮屏障功能调控，这引出了未来研究的一个有趣方向：PCDH1在呼吸道上皮细胞的大胞饮进入中是否发挥作用。作者表示，下一步将在BSL-3实验室用活病毒验证本研究中筛选出的候选抑制剂，推动其向治疗应用方向发展。