作者为Zongbao Zhou、Lei Wang、Yingkui Hu、Rijian Song、Naibin Mei、Tao Chen和Shunqing Tang。其中Zongbao Zhou和Lei Wang为共同第一作者，Shunqing Tang为通讯作者。研究单位包括广东省医疗器械研究所国家医疗保健设备工程研究中心、暨南大学生物医学工程研究所以及荷兰乌特勒支大学药理学系。该研究发表于*International Journal of Biological Macromolecules*第167卷，2021年，页码66–75。
本研究属于生物医用高分子材料表面功能化与抗细菌黏附研究领域。细菌在医用植入材料表面的黏附及随后形成的生物被膜（biofilm）是临床上植入物相关感染的核心问题。金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是植入物感染中最常见的革兰氏阳性病原菌，其黏附过程高度依赖细菌细胞壁上的分选酶A（sortase A，SrtA）。SrtA通过识别表面蛋白中的LPXTG基序，介导细菌对宿主基质蛋白的共价锚定，从而实现不可逆黏附。因此，抑制SrtA活性被认为是降低细菌黏附、阻断生物被膜形成的有效策略。芳基（β-氨基）乙基酮（aryl (β-amino) ethyl ketones，AAEK）是一种已被报道的SrtA抑制剂，能够可逆修饰SrtA活性位点Cys184的巯基，产生非竞争性抑制。然而，此前尚未有研究将AAEK固定于生物材料表面以赋予其抗黏附功能。本研究旨在通过点击化学反应将AAEK共价接枝到纤维素膜（cellulose films，CF）表面，制备具有抗菌与抗黏附活性的功能化纤维素膜，并系统评价其对金黄色葡萄球菌黏附及生物被膜形成的抑制效果以及细胞毒性。
研究流程主要包括四大部分：AAEK功能化纤维素膜的制备、表面化学结构表征、抗生物被膜活性评价和细胞毒性评价。首先，作者按照已有文献方法合成炔基化AAEK：以1-(4-乙炔基苯基)乙-1-酮、多聚甲醛和二甲胺盐酸盐为原料，在甲醇中经Mannich反应回流15小时，经柱层析纯化得到炔基化AAEK，产率为55.8%。其次，将商业纤维素膜裁剪成直径14 mm的圆形样品，用3-叠氮丙基三乙氧基硅烷（3-azidopropyltriethoxysilane，AZPTS）在干燥甲苯中于120 °C处理10小时，获得叠氮端基修饰的纤维素膜（AZPTS-CF）。随后，将炔基化AAEK通过铜催化的叠氮-炔基1,3-偶极环加成（copper-catalyzed azide-alkyne 1,3-dipolar cycloaddition，CuAAC）点击反应接枝到叠氮功能化纤维素膜表面，反应在80%乙醇/水溶液中进行，以硫酸铜和抗坏血酸钠为催化体系，室温反应8小时，得到AAEK功能化纤维素膜（AAEK-CF）。实验共设三组样品：未处理纤维素膜（blank-CF）、叠氮端基修饰纤维素膜（AZPTS-CF）和AAEK功能化纤维素膜（AAEK-CF）。
在表面表征方面，作者利用静态水接触角测量、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）对样品进行分析。接触角测试采用KRÜSS DSA100接触角测量仪，每组至少重复五次。ATR-FTIR使用Equinox 55光谱仪，扫描范围为4000–500 cm⁻¹，分辨率为2 cm⁻¹，扫描64次。XPS使用Thermo Scientific K-Alpha仪器，以单色化Al Kα为X射线源，采集C 1s、O 1s和N 1s高分辨谱，并利用Thermo Avantage软件进行谱峰拟合。结果表明，未修饰纤维素膜高度亲水，水接触角为16.6°±3.1°；叠氮修饰后接触角升高至80.8°±4.1°，说明硅烷偶联剂成功接枝；点击反应后接触角降低至61.2°±2.6°，推测与AAEK中的叔胺基团增强亲水性有关。ATR-FTIR光谱中，AZPTS-CF在2109 cm⁻¹处出现叠氮伸缩振动峰，而AAEK-CF中该峰消失，并且在1691 cm⁻¹处出现新的羰基伸缩振动峰，证实点击反应发生。XPS结果显示，AZPTS-CF和AAEK-CF均在约400 eV处出现N 1s特征峰。高分辨N 1s谱中，AZPTS-CF的叠氮峰在点击反应后消失，并出现位于约401 eV的1,2,3-三唑特征峰，进一步证明AAEK通过三唑环共价连接至纤维素膜表面。基于XPS元素定量分析，AAEK在纤维素膜上的接枝率为17.45%。
在抗生物被膜活性评价中，作者采用自制的生物被膜反应器，在流动条件下培养金黄色葡萄球菌，并分别于1、3和7天取样检测。菌落形成单位（colony-forming units，CFUs）计数结果显示，blank-CF表面细菌数量随时间增加，而AAEK-CF表面黏附细菌数量在整个7天培养期内均保持在较低水平。与blank-CF相比，AAEK-CF表面金黄色葡萄球菌菌落数在第1、3和7天分别降低了82.5%、72.3%和58.6%。结晶紫（crystal violet，CV）染色定量分析表明，AAEK-CF在第1、3和7天的生物被膜量分别比blank-CF减少了78.6%、87.1%和82.4%；而AZPTS-CF与blank-CF之间无显著差异，说明叠氮基团本身对生物被膜形成影响较小。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）观察显示，培养24小时后，blank-CF表面可见大量细菌聚集并形成成熟生物被膜，AZPTS-CF表面生物被膜也较成熟，而AAEK-CF表面未见生物被膜形成，仅有少量散在细菌且无聚集现象。活/死细菌染色实验中，使用SYTO 9和碘化丙啶混合染料对黏附细菌进行荧光染色，结果显示金黄色葡萄球菌在blank-CF表面形成高密度定植和生物被膜，AAEK-CF表面细菌覆盖率显著降低。定量图像分析表明，与blank-CF相比，AAEK-CF表面细菌覆盖率降低了84.2%±4.7%（p < 0.05）。同时，AAEK-CF表面并未出现死细菌比例显著增加，说明AAEK的作用机制主要是抑制细菌黏附而非直接杀菌。
在细胞毒性评价方面，作者使用NIH-3T3细胞进行CCK-8实验和活/死细胞荧光染色。CCK-8结果显示，与blank-CF相比，AZPTS-CF在培养48小时后表现出一定的细胞毒性，而AAEK-CF对细胞生长无明显抑制作用，表明AAEK的引入未增加膜的细胞毒性。荧光染色图像显示，NIH-3T3细胞在blank-CF表面生长良好，形态正常；在AZPTS-CF表面细胞生长较差且形态不规则；而在AAEK-CF表面细胞数量虽略少于blank-CF，但形态良好，未见大量死细胞。上述结果表明AAEK-CF具有良好的生物相容性，不会影响NIH-3T3细胞的黏附、增殖和分化。
综合以上结果，本研究通过点击化学将SrtA抑制剂AAEK成功接枝到纤维素膜表面，构建了具有抗细菌黏附和抗生物被膜功能的生物材料。AAEK-CF在流动条件下能够显著抑制金黄色葡萄球菌的黏附，并在7天内持续抑制生物被膜形成，同时对哺乳动物细胞无显著毒性。该研究为植入材料相关感染的防控提供了一种基于抑制细菌黏附而非直接杀菌的新策略。
本研究的亮点在于：首次将SrtA抑制剂AAEK共价固定于纤维素膜表面，并证实其抗金黄色葡萄球菌黏附和抗生物被膜效果；采用CuAAC点击化学实现了温和条件下AAEK的高效接枝；通过流动条件下的长期培养实验，更接近体内液体环境，验证了AAEK-CF抗黏附作用的持续性；同时，AAEK-CF不依赖杀菌机制，因此有望降低细菌产生耐药性的风险。此外，该研究还比较了AAEK修饰膜与壳聚糖膜的抗黏附性能，并发现AAEK-CF对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant *Staphylococcus aureus*，MRSA）仍具有较好的抗黏附性能，但对铜绿假单胞菌无抗黏附作用，这可能与革兰氏阴性菌缺乏SrtA受体有关。研究结果提示，基于SrtA抑制的表面功能化策略在抗革兰氏阳性菌感染方面具有良好的应用前景。